Chapitre 2
MATERIEL ET METHODES
I- Matériel
1-Provenance des produits chimiques
Les substrats [amidon soluble, oligosaccharides contenant le
résidu galactosyle, pNPglycoside,
pNP-â-N-acétyl-glucosaminide,
pNP-â-N-acétyl-galactosaminide,
carboxyméthylcellulose, maltodextrines, cellodextrines, saccharose,
gentiobiose, sophorose, laminaribiose, cellobiose, tréhalose,
nigérose, kojibiose, lactose, stachyose, mélibiose,
mélizitose, cellulose microcristalline, cellulose triacétate
microcristalline, pullulane, arabinogalactane, inuline] et les monosacharides
[glucose et xylose] sont des produits chimiques provenant de Sigma Chemical
Company (St. Louis, MO, USA).
Les produits de chromatographie [DEAE-Sepharose CL-6B,
phényl-éthyl-â-Dgalactoside et Sephacryl
S-100 HR] sont des produits chimiques provenant de PHARMACIALKB Biotech
(Uppsala, Sweden).
Les produits pour l'électrophorèse [acrylamide,
N,N'-méthylène-bis acrylamide, Tris, dodécyl sulfate de
sodium, N,N,N',N'tétraméthyléthylènediamine
(T.E.M.E.D), âmercaptoéthanol, glycérol,
bromophénol, glycine, bleu de Coomassie R-250 et persulfate d'ammonium]
ont été fourmis par BIO-RAD (Milan, Italy).
2-Origine du matériel biologique
Les larves de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)
du palmier Elaeis guineensis ont été
récoltées des palmiers déterrés ou abattus en voie
de putréfaction du Campus de l'Université d'Abobo-Adjamé
(Abidjan, Côte d'Ivoire).
II- Méthodes
1-Préparation de l'extrait brut
enzymatique
La larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) a
été rincée à l'eau distillée et
essorée sur du papier filtre. Le tube digestif a été
isolé du reste du corps dans une solution de chlorure de potassium (0,9
%, m/v) à l'aide d'une pince puis vidé de son contenu. Le suc
digestif ainsi obtenu a été dilué (1/1 ; v/v) dans une
solution de chlorure de potassium (0,9 %, m/v), puis centrifugé à
6000 trs/min pendant 30 min à 4 °C, à l'aide d'une
centrifugeuse réfrigérée (UNICEN ALRESA).
Le surnageant obtenu a été dilué (1/1 ; v/v) dans le
tampon acétate 100 mM pH 5,6 et recentrifugé dans les mêmes
conditions à 10000 trs/min. Le nouveau surnageant recueilli a
constitué l'extrait brut enzymatique issu du suc digestif.
Le tube digestif, vidé de son contenu, a
été abondamment lavé respectivement dans de l'eau
distillée et dans une solution de chlorure de potassium (0,9 %, m/v).
Ensuite, il a été placé dans un récipient
disposé dans un bac à glace tout comme les glandes salivaires qui
ont soigneusement été isolées des têtes des larves.
Ces différents tissus ont été ensuite broyés
séparément dans une solution de chlorure de potassium (0,9 %,
m/v) à l'aide d'un microbroyeur Ultra-turax (type T 25). Les broyats
totaux ont été centrifugés à 10000 trs/min pendant
30 min à 4 °C, à l'aide d'une centrifugeuse
réfrigérée (UNICEN ALRESA). Les
surnageants obtenus ont été dilués (1/1 ; v/v) dans le
tampon acétate 100 mM pH 5,6 et ont constitué les extraits bruts
enzymatiques issus des tissus du tube digestif et des glandes salivaires de la
larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae).
2- Techniques de dosage
2-1- Dosage de l'activité
polysaccharidasique
L'hydrolyse enzymatique des polysaccharides libère des
sucres réducteurs qui peuvent être dosés selon la
méthode de Bernfeld (1955) utilisant l'acide
3,5-dinitro-salycilique (DNS).
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