RESULTATS ET DISCUSSION
1. Purification, contrôle de pureté et
estimation de l'activité de la XO
La purification de la XO a été
réalisée par la méthode décrite par Nakamura et
Yamazaki (1982) modifiée par Baghiani et al., (2003) à
partir du lait bovin frais, par une série de centrifugations puis
précipitation au sulfate d'ammonium, suivie d'une chromatographie
d'affinité sur colonne de gel d'héparine basée sur
l'affinité de la XO aux glycosaminoglycanes sulphatés. Le
rendement de la purification est de 17.97 mg d'enzyme
purifiée par litre du lait bovin frais. Il est similaire à ce qui
est trouvé par Baghiani et al., (2002; 2003).
Le spectre d'absorption caractéristique de la XO par un
balayage spectrophotométrique (UVVis) a présenté trois
pics majeurs à 280, 325 et 450 nm (Figure 12A) qui est
similaire aux résultats obtenus par les travaux de Abadeh et al.,
(1992), Baghiani et ses collaborateurs (2002; 2003), Benboubetra et al, (2004).
Le rapport protéine / flavine PFR a été calculé
comme suit: A280nm / A450nm. La XOR purifiée a un PFR de7.18, donc
l'enzyme purifiée a une pureté acceptable parce qu'une valeur
proche de 5 est considérée comme critère de pureté
(Bray, 1975).
La pureté de l'enzyme a été
confirmée par une électrophorèse (SDS-PAGE). Le chemin
électrophorétique a présenté une bande majeure
d'approximativement 150 KDa (Figure12B) ce qui est similaire
aux résultats des études effectués en 2003 par Baghiani et
ses collaborateurs, et en 2004 par Atmani et ses collaborateurs.
PM 1 2
150 000
PM
220 000
100 000
65 000
40 000
30 000
Figure 12: Spectre d'absorption UV-Vis
(A), électrophorèse (SDS-PAGE)
(B) de la XO purifiée. B1: XO pure
(150 000 Da), B2: Standards des poids moléculaires (220
000; 100 000; 65000; 40 000; 30 000)
L'activité totale et l'activité de la forme
oxydase de l'enzyme purifiée a été estimée en
présence de xanthine comme un substrat réducteur et de NAD+ et
d'O2 comme substrat oxydant, et le pourcentage de la forme oxydase a
été par la suite calculé. Donc, l'enzyme pure a
présenté une activité totale de 2261 nmol / min / mg
protéine, et le pourcentage de la forme oxydase (XO) de l'enzyme a
été de 89 % (Tableau 2). Ces résultats
sont similaires à ceux de Baghiani et al., (2003), qui indiquent, que
l'activité de la XOR du lait des différentes espèces
mammifères est liée à la forme inactive démolybdo
de l'enzyme.
Tableau 2: L'activité totale et oxydase
de la XOR purifiée à partir du lait bovin frais.
Activité (nmol /min / mg protéine)*
Pourcentage de Rapport
la forme protéine/flavine
Totale Forme oxydase (XO) oxydase (XO) (PFR)
2261 2011 89 7.18
| 
