2.3. Estimation de l'activité enzymatique de la
XOR
L'activité totale de la XOR a été
estimée en suivant l'augmentation de la production de l'acide urique
à 295 nm, en présence de 100 jtM de xanthine
comme substrat de l'enzyme et 500 uM de NAD+ comme accepteur
d'électrons dissous dans un tampon Bicine buffer à pH 8.3 (Avis
et al., 1956). L'activité de la forme oxydase a été
mesurée par la même méthode mais en absence de
NAD+:
L'activité enzymatique totale = l'activité de la
forme O + l'activité de la forme D
L'activité enzymatique a été exprimée
en nombre de nano mole d'acide urique produit dans une minute par milligramme
de l'enzyme (nmols / min).
2.4. Extraction des flavonoïdes Cachrys libanotis
Les racines de la plante sont préalablement
nettoyées, séchées et broyées à l'aide d'un
mortier, 200 g de la poudre de Cachrys libanotis est mise à
macérer dans un mélange méthanol/eau (85 % V/V) à
un rapport de 1/10 (P/V), sous agitation douce pendant une nuit à
température ambiante. L'extrait hydro alcoolique est
récupéré dans un premier temps après filtration du
mélange au niveau du coton puis sur verre fritté (entonnoir
N°03) pour récupérer le filtrat 1 et conservé
à 4°C. L'extraction a été
répétée une fois et le précipité a
été complété à 1 L par le méthanol
50% pour avoir le filtrat 2 qui a été mélangé avec
le filtrat 1. Le mélange obtenu a été filtré pour
la dernière fois sur papier filtre. Le méthanol est
éliminé du filtrat par évaporation sous pression
réduite dans un rotavapeur (BÜCHI). Permettant ainsi d'obtenir un
extrait caractérisé par une couleur jaune foncée, qui est
considéré comme étant l'extrait brut (EBr) de Cachrys
libanotis. Un volume 50 ml de cet extrait a été soumis
à une évaporation jusqu'à l'élimination de l'eau
puis conservé à -20°C jusqu'à son utilisation puis
déterminer leur valeur en matière sèche ainsi que le
rendement d'extraction. Le volume restant sera fractionné
ultérieurement.
2.5. Fractionnement de l'extrait brut
L'extrait brut est fractionné selon la méthode
de Markham (1982) modifié par Boumarfag (2006), en utilisant une
série de solvants à polarité croissante (Figure
8). L'extrait brut est initialement mélangé avec
l'hexane (1 V/V), après décantation la phase organique
supérieure est récupérée. Cette étape est
refaite plusieurs fois avec renouvellement du solvant jusqu'à ce qu'il
devient transparent. L'hexane est par la suite évaporé et
l'extrait résultant est considéré comme étant la
fraction de l'hexane (EHx). La phase aqueuse inférieure est soumise
à un autre fractionnement par le chloroforme pour donner l'extrait du
chloroforme (ECh), et enfin par l'acétate d'éthyle pour donner la
fraction de l'acétate d'éthyle (EAc), en suivant les mêmes
étapes que le premier fractionnement par l'hexane. Le raffinat qui en
résulte représente la fraction aqueuse (EAq) les cinq fractions
ont été conservées à -20°C jusqu'à
utilisation. (Figure8).
Figure 8:Les étapes du
fractionnement de l'extrait brut de Cachrys libanotis.
Markham
(1982)
2.5.1. Dosage des composés
phénoliques
La teneur en composés phénoliques des
différents extraits de Cachrys libanotis a été
estimée par la méthode de Folin-Ciocalteu selon (Li et
al., 2007) qui est basée sur la réduction en milieux alcalin
de la mixture phosphotungstique (WO42-) phosphomolybdique ( MoO42-) de
réactif de Folin par les groupements oxydables des composés
phénoliques, conduisant à la
formation de produits de réduction de couleur bleue.
Ces derniers présentent un maximum d'absorption à 765 nm dont
l'intensité est proportionnelle à la quantité de
polyphénols présents. La concentration des polyphénols
totaux est calculée à partir de l'équation de
régression de la gamme d'étalonnage établie avec l'acide
gallique (0-160 jtg/ml) et est exprimée en
jig d'équivalent d'acide gallique par milligramme
d'extrait (jig EAG/mg d'extrait) , dans l'échantillon
(Georgé et al., 2005). Brièvement, 1 ml de
réactif de Folin (10 fois dilué) est ajouté à 200
jil d'échantillon ou standard (préparés
dans le méthanol ou l'eau distillée) avec des dilutions
convenables, Après 4 min, 800jil d'une solution de
carbonate de sodium (75 mg/ml) sont additionnés au milieu
réactionnel. Après 2 h d'incubation à température
ambiante l'absorbance est mesurée à 765nm.
La concentration des poly phénols totaux est
calculée à partir de l'équation de régression de la
gamme d'étalonnage établie avec l'acide gallique (0-160
jig/ml) et est exprimée en jig
d'équivalent d'acide gallique par milligramme d'extrait
(jig EAG/mg d'extrait).
1,4
y = 0,0074x + 0,1167
R2 = 0,9968
|
Absorbance
|
1,2
1 0,8 0,6 0,4 0,2
0
|
0 50 100 150
concentration ug/ml
Figure 9 : courbe d'étalonnage de
l'acide gallique. Chaque point de la courbe représente la
moyenne
#177; SEM (n =3).
| 
