2. Méthodes
2.1. Purification de la xanthine oxydase
La purification de la xanthine oxydase du lait bovin (BMXO) a
été conçue suivant la technique de Nakamura et Yamazaki
(1982) modifiée par Baghiani et al. (2003). le lait bovin a
été centrifugé à 5000 rpm pendant 20 minutes. La
crème extraite à partir de la centrifugation, a été
dissoute dans un tampon composé de phosphate de potassium 0,2 M, 1mM
EDTA et 5mM de DTT. Ce mélange a été soumis à une
agitation douce durant 1h 30 mn, puis recentrifugé à 5000 t/m
/20mn. Le surnagent récupéré additionné
progressivement de 15 % (V/V) du butanol froid (-20°C) et de sulfate
d'ammonium 15% (P/P), sous agitation pendant 1 heure, une fois de plus
centrifugé à 10000 T/m pendant 20 mn. Apres cette
opération, une autre filtration du surnageant sur de la laine de verre
est intervenue, d'ou la XO à été précipité
par un ajout progressif de sulfate d'ammonium 20% (P/V) sous agitation douce
durant une nuit, puis centrifugation à 11000T/M pendant 30 mn. Le
précipité (brunâtre) a été
récupéré doucement et resuspendu dans 20 ml de tampon
héparine (NaH2PO4 / Na2HPO4 25 mM, contenant 1 mM d'EDTA, (pH = 6.2), et
dialysé contre ce même tampon pendant une nuit sous agitation.
Afin d'éliminer les impuretés insolubles, le dialysat a
été centrifugé à
18000 rpm pendant 60 min. Après filtration à
travers un filtre de 45 JIm, le produit final constitue
l'extrait brut de la XO.
L'extrait brut obtenu a été déposé
sur une colonne chromatographique contenant un gel d'héparine-agarose
équilibré et lavé par le même tampon
héparine. La XO a été récupérée de la
colonne par le tampon héparine contenant 0.2 M de NaCl, et
dialysée contre un tampon Bicine 50 mM, pH 8.3, pendant une nuit. Enfin,
l'enzyme a été répartie en aliquotes de 0.5 ml et
conservée à -20 °C jusqu'à son utilisation. La
colonne a été régénérée par lavage
avec une solution de NaCl 1 M puis avec le tampon héparine pour une
nouvelle utilisation.
2.2. Contrôle de pureté de la XO
La pureté de l'enzyme purifiée a
été estimée par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE)
et par le rapport protéine / flavine PFR (Protein to Flavin Ratio),
correspondant à la lecture de l'absorbance aux longueurs d'ondes 280 nm
et 450 nm (A280nm / A450nm). Une valeur 5 ou proche de 5 est un bon signe de
pureté (Bray, 1975).
> L'Électrophorèse sur le gel de
polyacrylamide
L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide
(SDS-PAGE) a été réalisée selon la méthode
de Laemmli (1970); le gel de séparation (10 % d'acrylamide et 2.74 % de
bis-acrylamide) a été préparé dans un tampon
Tris-HCl (0.125 M, pH 6.8) contenant 0.1 % de SDS (P/V) et
polymérisé par ajout de 0.042 % de N,N,N'N' Tetramethylene
diamine (TEMED) (V/V) et 0.1% de persulfate d'ammonium (P/V). Le gel de
concentration a été préparé dans le même
tampon Tris-HCl (0.125 M, pH 6.8) contenant 0.1% de SDS (P/V) et
polymérisé par ajout de 0.1% de TEMED (V/V) et 0.1% de persulfate
d'ammonium (P/V). Les échantillons (XO, environ 1 mg / ml) ainsi que les
standards des poids moléculaires (1 mg / ml) ont été
préparés dans une solution échantillon constituée
d'un tampon Tris-HCl (62.5 mM, pH 6.8), 2 % de SDS (P/V), 20 % de
glycérol (V/V) et 0.005 % de bleu de bromophénol (P/V). Ensuite,
ils ont été chauffés à 100 °C pendant 5
minutes. Les standards des poids moléculaires (Sigma) utilisés
sont de 29000 Da à 205000 Da.
La migration électro phorétique a
été réalisée dans un tampon Tris-HCl (25 mM)
contenant
0.192 M de glycine et 0.1 % de SDS (P/V) par application d'un
courant électrique de 10 mA
jusqu'à ce que les
protéines pénètrent dans le gel de séparation,
l'ampérage a été ensuite
augmenté jusqu'à 37- 45 mA. Les protéines
séparées ont été colorées pendant au moins
une heure dans une solution de bleu de Coomassie 0.2 % (P/V) contenant 10 %
d'acide acétique (V/V), 45 % de méthanol (V/V) dans de l'eau
distillée. Le gel a été ensuite décoloré par
une solution d'acide acétique 5-10 % (V/V).
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