II.3.2.3.4 Preparation des cibles :
egiagotertique et laid/ Caton deo
détutpatideo tiralipteo
Elle est habituellement identique à la
cytogénétique classique : préparation de lames de
chromosomes en métaphase ou prométaphase. Des
préparations spécifiques particulières sont parfois
employées : études en interphase, chromatine
étirée, peignage moléculaire de l'ADN, coupes
tissulaires...
.oupures : actionvité
exonucléasique arqués (dxtp).
; 2004.
11.3.1.3.5 Detection des sondes :
- Détection par immunofluorescence :
Les sondes marquées par des haptènes sont
révélées par immunoréaction grâce à
des anticorps spécifiques couplés à des
fluorochromes. Le montage peut comporter un seul anticorps
(immunodétection directe, (
figure 20) ou plusieurs anticorps
superposés pour amplifier le signal (
immunodétection indirecte). La difficulté est ici
d'obtenir un rapport signal/bruit satisfaisant avec un minimum
de bruit de fond (Knezevich et al., 1998).
- Détection directe :
Les sondes étant directement fluorescentes, la
détection ne nécessite pas d'amplification du
signal ; son utilisation en est donc plus facile, plus
rapide et moins parasitée par le bruit de fond
11.3.2.3.6 Analyse au microscope
~
La FISH nécessite un microscope à
épifluorescence équipé de filtres appropriés
aux nombreux fluorochromes disponibles : isothiocyanate de
fluorescéine (vert-jaune), rouge Texas, rhod amine
(rouge), coumarine (bleu), etc.. ). Les molécules
émettent une lumière lorsqu'elles sont
excitées par une longueur d'onde appropriée. Des filtres sont
disponibles avec plusieurs bandes passantes permettant de
détecter plusieurs couleurs durant la même observation (figure
22) , F1: double bande passante, figure F2 : triple
bande). L'observation de couleurs difficilement perceptibles
par l'oeil humain (cyanine, rouge sombre) ou la distinction de
combinaisons
nombreuses couleurs (Multi-FISH, figure
22 E) bénéficient indéniablement de
l'avantage des caméras numériques de capture couplées au
microscope. Il en est de même des logiciels adaptés au traitement
de l'image.
11.3.2.3.7 Application clinique :
La cytogénétique moléculaire
intéresse tous les domaines de la cytogénétique classique
: constitutionnelle : post et prénatale ainsi que récemment le
diagnostic préimplantatoire ; analyse des anomalies acquises :
onco-hématologie, tumeurs solides (tableau V).
Devant les différentes possibilités techniques offertes par la
cytogénétique, le prescripteur peut être
dérouté dans sa démarche diagnostique : caryotype
conventionnel standard ou en haute Résolution, sur fibroblastes,
recherche de la fragilité de l'X, FISH avec recherche de
microdélétions, association d'une étude en biologie
moléculaire, Multi-FISH, étude
Tableau V : Principales indications de la FISH
Cytogénétique. (Le diagnostic
préimplantoire n'est pas
indiqué dans ce dernier)
M.jeaunepier et al. GENETIQUE
MEDICAL ;ISBN2 29400812X ;; 2004.
"pantélomèrique"... sont autant d'analyses
disponibles : un minimum de connaissances est nécessaire aux
médecins impliqués notamment dans le cadre diagnostique du retard
mental. Cette connaissance associée à une réflexion
clinique appropriée, permet de prescrire à bon escient en
collaboration avec le cytogénéticien les examens
adaptés.
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