1.3.2.3.1 Princibe .
mique sont indiquées
chromosome
omes homologues.
2004.
Le principe général de la FISH est
illustré par la (figure 20).
Les techniques d'hybridation in situ sont
fondées sur la propriété de réassociation
spécifique des acides nucléiques. Une sonde
dénaturée (ADN simple brin marqué) en solution
peut s'hybrider spécifiquement avec sa séquence cible
(préparation chromosomique dénaturée) grâce à
la complémentarité des bases nucléotidiques.
La sonde s'apparie par des liaisons hydrogène établies
selon les critères de Watson et Crick. Les hybrides
infidèles et les molécules de sonde non hybridées sont
éliminés par l
avages, puis les hybrides spécifiques sont
révélés, en général par
immunodétection et enfin l'observation s'effectue grâce à
un microscope à épifluorescence. L'introduction de
marqueurs
non radioactifs a permis de s'affranchir de la lourdeur des
techniques utilisant des radio-isotopes réservés aux laboratoires
de recherche. De nombreuses améliorations ont permis d'obtenir une
qualité et une reproductibilité remarquable (sondes
clonées, amélioration des solutions d'hybridation....). Son
utilisation pratique est relativement facile et rapide.
II.3.2.3.2 Diversité des sondes :
De nombreuses sondes sont actuellement disponibles et
commercialisées, elles sont principalement de 4 types :
(figure 22
- peinture chromosomique (spécifique d'un chromosome
entier ; figure A et E),
- locus spécifique (correspondant à un petit
fragment chromosomique ; figures B et F)
- télomérique (figure C),
- centromérique (figure D)
En dehors d'applications particulières telle que l'HCG
dont la sonde correspond à un génome entier, l'ADN est obtenu
après clonage dans un vecteur ou par synthèse in
vitro (tableau IV). Une méthode permet par
diverses approches d'obtenir un caryotype "en couleur" grâce à
l'utilisation de l'informatique et du traitement d'image : chaque chromosome
est repéré par une
combinaison spécifique de fluorochromes et donc une
couleur qui lui est spécifique (Multi-FISH, Planche I, Figure E).
Tableau IV : différents types de sondes avec
indication des tailles maximales
M.jeaunepier et al. GENETIQUE
MEDICAL ; ISBN2 29400812X ; 2004.
11.3.2.3.3 Marquage des sondes :
Pour permettre leur détection spécifique les sondes
sont marquées soit par des procédés
enzymatiques (figure 21) par
introduction d'haptène (biotine, digoxigénine), soit par
procédés chimiques. Actuellement de nombreux fournisseurs
proposent des sondes directement marquées par des fluorochromes
modifiés.
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