Memoire Online - Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

Avant de débuter l'analyse structurale de K2 par RMN, nous avons voulu nous assurer

de la fiabilité et de l'efficacité de la méthode employée pour obtenir les échantillons de protéine. La séquence primaire des protéines K2 simplement et doublement marquée a été contrôlée par spectrométrie de masse ITD-MS (Ion Trap Detector-Mass Spectroscopy) sous ionisation par ESI (ElectroSpray Ionization).

Après concentration sur cellule Amicon, 2 uL d'un échantillon de K2 ont été prélevés

et introduits dans une solution contenant, 100 uL d'H2O, 100 uL d'acétonitrile, et de l'acide formique (0.25% pour K2 ¹⁵N, et 0.75% pour K2 ¹⁵N / ¹³C). 10 uL de ce mélange contenant environ 15 ng/uL de K2 ont ensuite été injectés dans la source ESI, puis analysés avec un enregistrement de 20 accumulations. Les spectres obtenus sont présentés en Figure 2.7 et les

Figure 2.7 : Analyse ESI-ITD-MS des échantillons de K2 ¹⁵N et K2 ¹⁵N / ¹³C.

Le spectre de masse de K2 simplement marqué ¹⁵N fait apparaître une enveloppe d'ions multichargés centrée autour d'un ion nonachargé. La déconvolution de cette enveloppe permet de conclure à la présence d'une forme unique de masse expérimentale 13836 #177; 3 Da. Cette masse correspond tout à fait à celle attendue et indique que la protéine simplement marquée ¹⁵N a été produite avec un enrichissement isotopique total ou quasi-total.

Sur le spectre de l'échantillon doublement marqué, on observe la présence d'un massif

isotopique pour chaque multichargé. L'apparition de ces amas traduit l'existence de plusieurs formes isotopiques de K2, et suggère que le double marquage n'est pas total. La déconvolution automatique d'un tel spectre n'étant pas possible, nous avons réalisé une déconvolution manuelle de chaque pic majoritaire correspondant aux 4 ions multichargés les plus intenses. Les résultats obtenus indiquent que la forme isotopique prédominante possède une masse expérimentale de 14379 #177; 3 Da pour une masse attendue de 14445 Da. Le taux d'enrichissement isotopique de l'échantillon ¹⁵N / ¹³C peut donc être estimé à 92%.

Echantillon

masse théorique [Da]

masse expérimentale

(déconvolution) [Da]

taux d'enrichissement

K2 ¹⁵N

13838,9

13836 #177; 3

~ 100 %

K2 ¹⁵N / ¹³C

14445,3

14379 #177; 3

~ 92 %

Tableau 2.3 : Caractérisation de la production des échantillons de K2 simplement et

doublement marqués par analyse ESI-ITD-MS. Les masses théoriques sont indiquées en considérant un enrichissement isotopique de 100%.

Une fois le poids moléculaire du domaine protéique vérifié par spectroscopie de masse, nous avons entrepris une analyse par chromatographie de gel filtration afin de caractériser l'état oligomérique de K2 en solution. Cette technique chromatographique d'exclusion permet de séparer des molécules en fonction de leur poids moléculaire, et cela en conditions non dénaturantes en choisissant un tampon d'équilibration adapté.

La colonne de filtration sur gel que nous avons utilisée est une colonne Superdex75

HR analytique (Pharmacia) de 24 mL dont la gamme de résolution se situe entre 70 et 3 kDa.

200 uL d'un échantillon concentré de protéine doublement marquée ¹⁵N / ¹³C (soit environ

300 ug) ont été introduits dans cette colonne préalablement équilibrée avec une solution tampon de PBS (Phosphate Buffer Saline : 150 mM NaCl, 10 mM phosphate, 2.5 mM KCl,

pH 7.4). L'élution des protéines a été détectée par suivi de l'absorbance à 280 nm. En amont

de l'analyse de K2, la Superdex75 a été étalonnée dans les mêmes conditions avec un kit de calibration contenant un mélange de protéines standard.

Le chromatogramme de l'analyse de K2 doublement marquée fait apparaître un pic

ultra majoritaire à un volume d'élution de 12.22 mL (Figure 2.8A). En se basant sur les volumes de rétention des protéines standard, ce volume correspond à un poids moléculaire d'environ 18 kDa pour une masse théorique monomérique attendue de 14.5 kDa. Il semble donc que la structure quaternaire du domaine K2 soit monodisperse et sous forme monomérique dans ces conditions d'analyse très proches des conditions RMN. Ce résultat est cependant nuancé par l'apparition d'un petit pic à 10.39 mL (~38 kDa) qui pourrait correspondre à une forme dimérique très minoritaire, ou à une impureté non observable sur le

gel SDS-PAGE (Figure 2.8B). Par ailleurs, la chromatographie de gel filtration est certes une technique simple et rapide, mais elle ne fournit qu'une indication de l'organisation quaternaire d'une protéine dans un tampon donné. Ce résultat doit donc être considéré avec précaution ou confirmé par des études plus précises de diffusion de la lumière ou

Figure 2.8 : Caractérisation de la structure quaternaire de K2 ¹⁵N / ¹³C. A) chromatogramme

de l'analyse par gel filtration en conditions non dénaturantes. B) analyse SDS-PAGE du même échantillon (conditions dénaturantes).

Le dichroïsme circulaire (DC) est une méthode simple et sensible qui permet d'évaluer

le niveau de structuration d'un polypeptide. La technique repose sur les propriétés spectroscopiques des molécules chirales qui absorbent les composantes polarisées circulaires droite et gauche de la lumière de manière inégale. Dans le cas des protéines, le phénomène de dichroïsme circulaire est essentiellement dû à leur structure secondaire dans l'UV lointain

(région dominée par l'absorption des liaisons peptidiques), et à leur structure tertiaire dans

l'UV proche (région dominée par l'absorption des cycles aromatiques). Aussi, chaque type de conformation présente un profil d'absorption qui lui est propre (Yang et al., 1986).

Selon ce principe, l'analyse des spectres de DC permet de distinguer sans aucune ambiguïté une protéine repliée d'une protéine non structurée. C'est dans cette optique que nous avons entrepris l'analyse du domaine K2 par dichroïsme circulaire. Les spectres de DC

ont été enregistrés sur un échantillon de K2 non marquée afin de vérifier la structuration de la protéine avant de la produire en grande quantité en milieu minimum et Algone.

L'analyse a été menée à 25°C en solvant H2O contenant 50 mM de tampon phosphate

à pH 7.0, et 200 mM de NaCl. Le spectre enregistré dans l'UV lointain présente un minimum

à 208 nm spécifique de la conformation hélicoïdale (Figure 2.9). Cependant, aucun autre minimum n'est clairement discernable dans la région autour de 222 nm. Ce profil d'absorption est caractéristique d'une protéine structurée en partie en hélice á et en feuillet â (Venyaminov & Yang, 1996). Par ailleurs, le signal d'un spectre DC enregistré dans l'UV proche est généralement très faible en absence de conformation ordonnée. Dans le cas de la protéine K2, deux minima intenses apparaissent à 279 et 288 nm et correspondent à l'absorption de cycles aromatiques de tyrosine et de tryptophane d'une protéine adoptant une structure tertiaire stable.

Figure 2.9 : Spectres de dichroïsme circulaire enregistrés sur un échantillon de protéine K2

Dans l'optique de confirmer les résultats obtenus par dichroïsme circulaire, nous avons débuté l'étude RMN par l'enregistrement des spectres 1D ¹H et 2D HSQC ¹⁵N-¹H sur un échantillon de protéine simplement marquée ¹⁵N. Ces expériences ont été réalisées sur un spectromètre 600 MHz équipé d'une cryosonde TXI triple résonance dans les conditions initiales suivantes : une température de 20°C, un tampon phosphate de pH 7.0, et une concentration de protéine d'environ 0.7 mM.

Une protéine structurée présente une signature très différente d'une protéine peu ou

pas structurée sur un spectre HSQC ¹⁵N-¹H du fait de la variation de l'environnement chimique induite par les structures secondaire et tertiaire. La dispersion globale des pics de corrélation sur le spectre HSQC de K2 confirme que la protéine est repliée (Figure 2.10). Ainsi, les pics situés à gauche de la région centrale, à un déplacement chimique ¹H supérieur à

9 ppm, sont généralement caractéristiques d'une structuration en feuillet â. D'autre part, le spectre 1D ¹H fait apparaître des raies de résonance à un déplacement chimique négatif dans

la région des protons aliphatiques. Ces observations sont typiques d'une protéine repliée

Figure 2.10 : Spectre 2D HSQC ¹⁵N-¹H de K2 simplement marqué ¹⁵N (tampon phosphate, pH=7.0) enregistré sur un spectromètre 600 MHZ et à 20°C.

Le nombre de pics de corrélation présents sur ce spectre est difficile à comptabiliser en

raison d'une superposition importante dans la région centrale. Il est d'autant plus difficile à déterminer que la largeur des raies de résonance est importante à cette température. On peut toutefois estimer ce nombre proche de 100 sachant que le nombre de groupements amides attendu s'élève à 107 (111 résidus dont 3 prolines, et en considérant que le groupement amide NH2 du premier résidu est généralement non observable).

Afin de déterminer si les conditions initiales choisies étaient adaptées à une étude complète par RMN, nous avons enregistré une première série de 4 expériences 3D hétéronucléaires sur un échantillon ¹⁵N / ¹³C de K2. Il s'agit des expériences 3D HNCO, HNCA, CBCA(CO)NH, et CBCANH, qui permettent l'attribution de la chaîne principale et

des Câ. Pour chaque expérience, le nombre de pics qui apparaissent dans les spectres a été comptabilisé et figure dans le tableau 2.4. Bien que la HNCO soit l'expérience 3D la plus sensible, dans ces conditions d'analyse, 16 déplacements chimiques de carbonyle sont manquants. Les expériences HNCA et CBCA(CO)NH ne contiennent qu'environ 80% de données attendues. CBCANH, la moins sensible des 4 expériences, mais néanmoins majeure dans la stratégie d'attribution, ne contient qu'un peu plus du tiers de données attendues. Au final, la quantité d'information recueillie sur les spectres semble insuffisante pour envisager une attribution quasi-complète du squelette de K2. Par conséquent, nous avons conclu que les conditions initiales d'analyse (pH=7.0 et T=20°C) ne sont pas les plus adaptées pour attribuer

Tableau 2.4 : Analyse des spectres HNCO, HNCA, CBCA(CO)NH, et CBCANH de K2

doublement marquée ¹⁵N / ¹³C (pH=7,0) enregistrés sur un spectromètre 600 MHZ et à 20°C.

A ce stade de l'étude, une optimisation des conditions de l'analyse par RMN est apparue indispensable avant de débuter l'analyse d'une longue série d'expériences pouvant s'échelonner sur plusieurs semaines. Les deux principaux paramètres qui influent sur la qualité et la quantité de signal des spectres RMN sont le pH et la température.

L'absence d'une dizaine de corrélations de groupement amide sur le spectre HSQC de

K2 peut être expliqué par un échange rapide de protons amides accessibles avec les protons de l'eau. La plupart des expériences 3D hétéronucléaires utilisées pour l'attribution reposent sur

la corrélation d'un ou plusieurs atomes avec les noyaux ¹H et ¹⁵N amides. Par conséquent,

l'échange rapide des protons amides avec le solvant affecte également la quantité de signal

sur ces spectres. Une diminution du pH de l'échantillon permet de réduire la vitesse de cet échange (Figure 2.11). Cette vitesse est minimum entre pH 3 et 4. Cependant, un pH trop acide peut déstabiliser le repliement et conduire à une déstructuration partielle ou totale de la protéine. L'optimisation de ce paramètre a donc pour objectif de déterminer la valeur de pH à laquelle l'information enregistrée est maximum et le risque de dénaturation minimum.

Figure 2.11 : Influence du pH sur l'échange des protons amides accessibles au solvant. Tk représente le temps moyen d'échange de proton amide labile de polypeptide dans un solvant H2O et à 25°C (d'après Wüthrich, 1986).

Le spectre HSQC de K2 enregistré à 20°C présente une région centrale encombrée et peu résolue. La cause de ce manque de résolution est notamment imputable à la largeur de raie des pics de corrélation. Une augmentation de la température permet de réduire la viscosité

de l'eau, et de raccourcir le temps de réorientation globale ôc de la macromolécule. Ceci se

traduit par un affinement des raies, et donc par une amélioration de la résolution. De plus,

l'augmentation de l'agitation brownienne peut influer sur la fréquence de résonance propre de certains noyaux et permettre l'éclatement d'un massif. Cependant, les échantillons de protéine sont généralement moins stables à haute température car la tendance à la dénaturation, et l'activité des protéases résiduelles issues de E. coli, sont alors plus prononcées. Comme pour

le pH, le choix de la température doit donc résulter d'un compromis entre l'amélioration de la résolution spectrale et le risque associé de dénaturation.

L'influence du pH et de la température a été évaluée sur un échantillon de K2 simplement marqué ¹⁵N concentré à 0.8 mM. Une série d'expériences HSQC ¹⁵N-¹H a été entreprise sur un spectromètre 500 MHz dans 6 conditions expérimentales différentes. Chaque spectre a été enregistré et traité de la même façon et le nombre de pics (hors groupements NH

ou NH2 de chaîne latérale) a été comptabilisé pour chaque condition testée (Tableau 2.5).

Condition	pH=7.0		pH=6.5		pH=6.0
	T=25°C	T=30°C	T=25°C	T=30°C	T=25°C	T=30°C
nb de pics	89	98	101	103	110	110

Tableau 2.5 : Analyse des spectres 2D HSQC ¹⁵N-¹H de K2 simplement marquée enregistrés

sur un spectromètre 500 MHz dans différentes conditions de température et de pH.

Tous les spectres HSQC enregistrés présentent le même profil, similaire à celui obtenu dans les conditions initiales. Par conséquent, la protéine K2 conserve un repliement stable aux différents pH et températures testés.

L'effet du pH sur la vitesse d'échange des protons amides de K2 est clairement visible

sur les spectres HSQC. On observe bien une augmentation du nombre de résonances avec la diminution du pH. Jusqu'à 110 pics peuvent être comptabilisés à pH 6.0 pour un nombre attendu de 107. La figure 2.12 illustre l'influence de ce paramètre sur la région gauche du spectre qui fait apparaître de nouvelles taches de corrélation à pH plus acide. D'autre part, nous avons constaté que la diminution du pH permet d'accroître l'intensité de la majorité des raies de résonance de K2. Ce gain de signal est particulièrement intéressant dans l'optique de

recueillir davantage d'information sur les spectres 3D hétéronucléaires. L'effet de la

température est également visible sur l'allure générale des spectres. La résolution de la région centrale croît avec l'augmentation de la température, ce qui permet de mieux distinguer les pics de corrélation.

Figure 2.12 : Extrait de spectres 2D HSQC ¹⁵N-¹H de K2 simplement marquée ¹⁵N enregistrés

sur un spectromètre 500 MHz dans différentes conditions de température et de pH.

Finalement, à la vue de l'ensemble de ces résultats, nous avons retenu comme conditions expérimentales, une température de 30°C, et un pH de 6.0 pour mener l'étude structurale de K2 par RMN.

Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

2) Caractérisations préliminaires