Memoire Online - Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

Le Laboratoire de Marquage des Protéines du CEA de Saclay (LMP) a récemment élaboré un Programme de Production et Marquage des Protéines (3PM) qui a pour objectif de produire en grande quantité, chez la bactérie E. coli, des protéines solubles, pures, et sous forme native en vue de leur caractérisation structurale (Braud et al., 2005). La stratégie mise

en oeuvre pour obtenir de tels résultats a été présentée en détail dans le chapitre 4 de la première partie de ce manuscrit, consacrée à l'étude structurale de la protéine PRODH humaine. Elle repose notamment sur un criblage systématique de plusieurs conditions expérimentales. Toutes les étapes relatives au clonage, au criblage des conditions d'expression, à la production à grande échelle en milieu non marqué, et à la purification du domaine K2 ont été menées avec succès par les chercheurs du LMP dans le cadre de cette plate-forme de production. Ainsi, les quantités de protéine K2 soluble et pure obtenues à l'issue du processus 3PM étaient suffisantes pour envisager la préparation des échantillons pour l'analyse structurale.

La stratégie d'attribution de l'ensemble des raies de résonance RMN d'une protéine de

111 acides aminés comme K2 repose sur l'enregistrement d'expériences hétéronucléaires triple résonance (¹H, ¹⁵N, ¹³C), et nécessite la préparation d'échantillons uniformément marqués ¹⁵N et ¹⁵N / ¹³C. En contrôlant de manière stricte les sources d'azote et de carbone d'un milieu de culture, il est possible de produire des protéines simplement ou doublement marquées de façon uniforme avec des rendements de marquage(s) isotopique(s) proches de

100%. Le contrôle total du milieu impose généralement des milieux pauvres (milieu minimum), dont le plus fréquent est le M9 (Maniatis et al., 1982). Par comparaison avec le LB, ce type de milieu est appauvri en métabolite, nécessite l'adaptation de l'hôte bactérien, et entraîne par conséquent une diminution de la croissance bactérienne, ainsi qu'une baisse du rendement de production. Pour pallier ces inconvénients, l'une des solutions consiste à enrichir le milieu M9 avec des vitamines et des oligo-éléments qui contiennent peu d'atomes

de carbone et d'azote (Jansson et al., 1996). D'autre part, il existe des milieux riches contenant une réserve de métabolites bio-disponibles et adaptés au(x) marquage(s) isotopique(s) uniforme(s) (Reilly & Fairbrother, 1994). Ces milieux sont pour le plus souvent

issus d'un hydrolysat de microorganismes photosynthétiques, ce qui est le cas du milieu

Algone préparé au LMP à partir de cultures de cyanobactéries Spirulina maxima doublement

La modification d'une condition expérimentale telle que le milieu de culture peut nuire

à la qualité du profil d'expression d'une protéine. Par conséquent, il est nécessaire d'entreprendre une seconde étape d'optimisation de l'expression de K2 en milieux marqués avant de préparer les échantillons RMN. Celle-ci a été réalisée en milieu minimum sur la base des meilleurs résultats obtenus à l'issue du criblage des conditions d'expression en microplaques, puis en milieu Algone.

Le domaine K2 de la protéine KIN17 a été exprimé dans 30 conditions expérimentales différentes : 5 partenaires de fusion (His, Gb1, ZZ, GST, et Trx), 3 souches d'expression (BL21 Star, BL21 AI, et Rosetta DE3), et 2 températures (37°C et 20°C). Bien que les 3 souches testées conduisent globalement à de bons taux d'expression et de solubilité, les meilleurs résultats ont été obtenus en souche Rosetta (DE3). Le tableau 2.1 présente les taux

de protéines soluble et insoluble obtenus dans cette souche après analyse sur gel SDS-PAGE.

K2	His		Gb1		ZZ		GST		Trx
	S	I	S	I	S	I	S	I	S	I
37°C	+	+	++(+)	++	++	+++	+	+++	+	+(+)
20°C	++	+++	+	+	+++	+	+++	++	++++	+(+)

Tableau 2.1 : Analyse de l'expression et de la solubilité des protéines de fusion K2 en souche

Rosetta. Après dépôt des fractions soluble (S) et insoluble (I) sur gel SDS-PAGE, chaque bande de surexpression a été analysée, et une valeur semi-quantitative a été associée à son intensité, de faible (+) à très forte (++++). Les meilleures conditions sont mises en évidence par une coloration orange.

Au vu de ces résultats, on constate que la nature du partenaire de fusion combinée à la température d'expression a un effet notable sur la solubilité des protéines hétérologues K2. Ainsi, les meilleurs taux d'expression de protéine soluble ont été obtenus à 20°C et lorsque

K2 est en fusion avec les partenaires ZZ, GST, ou Trx. Au final, l'association partenaire Trx,

souche Rosetta, et température de 20°C constitue la meilleure condition d'expression à l'issue

100 mL dans des erlenmeyers de 1 L. Les 3 meilleures conditions déterminées précédemment

ont été testées ; la protéine K2 a été exprimée en fusion avec respectivement, GST, Trx, et ZZ,

en souche Rosetta (DE3) cultivée à 20°C. Pour chaque construction, les étapes principales du protocole d'expression sont les suivantes :

La souche Rosetta (DE3) est transformée par le plasmide d'expression d'intérêt, puis mise en culture en milieu LB à 37°C. Après quelques heures, une préculture en milieu minimum est ensemencée puis incubée à 37°C sous agitation. La culture d'expression de 100 mL est inoculée avec un volume de préculture, et l'expression de K2 est induite à 20°C pendant 14 heures par ajout de 1mM d'IPTG lorsque la DO600 atteint 1.2. Les culots bactériens sont repris et lysés dans un tampon phosphate, et après centrifugation, les fractions soluble et insoluble sont analysées sur gel SDS-PAGE (Figure 2.1).

Figure 2.1 : Expression des protéines de fusion GST-K2 (43.2 kDa), Trx-K2 (28.7 kDa), et

ZZ-K2 (33.3 kDa) en souche Rosetta cultivée à 20°C en milieu minimum non marqué. Analyse SDS-PAGE des fractions soluble (S) et insoluble (I) pour les 3 partenaires testés. Les protéines de fusion sont mises en évidence par des points rouges.

divergent significativement de ceux obtenus en milieu LB. La différence la plus spectaculaire concerne la fusion GST qui conduit à une expression de protéine très majoritairement insoluble en milieu minimum. L'expression de K2 en fusion avec Trx est tout à fait remarquable en milieu minimum, aussi bien dans la fraction soluble, que dans la fraction insoluble. On retrouve ce résultat pour le partenaire ZZ, bien que l'expression sous forme soluble soit plus importante que sous forme insoluble.

Les fusions ZZ et Trx conduisant à des taux d'expression de protéine soluble comparables, le choix du partenaire a été guidé par d'autres considérations. Ainsi, l'apparition d'un trouble persistant dans la fraction soluble de K2 fusionnée à Trx a révélé une propension lente à l'agrégation de cette construction. De plus, en anticipant sur la purification de la protéine hétérologue, les résines d'affinité spécifique à ZZ s'avèrent moins coûteuses que celles spécifique au partenaire Trx. Par conséquent, nous avons choisi de préparer les échantillons marqués pour l'analyse RMN en produisant le domaine K2 en fusion avec le partenaire ZZ en souche Rosetta (DE3) cultivée à 20°C.

Bien que préparé au LMP, l'Algone est un milieu riche très onéreux. Afin de réduire

les coûts de production de l'échantillon doublement marqué ¹⁵N / ¹³C, ce milieu peut être dilué avec de l'eau MilliQ. Toutefois et à l'image des milieux pauvres, une diminution de la réserve métabolique du milieu de culture, entraînée par une dilution, peut avoir pour conséquence une modification du profil d'expression de la protéine recombinante. L'optimisation de l'expression de K2 en milieu Algone a ainsi pour objectif de déterminer le milieu le plus dilué permettant d'obtenir le meilleur taux de protéine soluble.

La production de K2 fusionnée à ZZ en souche Rosetta (DE3) cultivée à 20°C a été menée en volume de 30 mL dans des erlenmeyers de 300 mL. Trois dilutions d'Algone 1/3,

1/2, et 2/3 ont été testées, ainsi que le milieu Algone 100 %. Les résultats de cette optimisation mettent en évidence que le profil d'expression de la protéine de fusion ZZ-K2 en milieu Algone est quasiment identique à celui obtenu en milieu minimum non marqué, quelle

Figure 2.2 : Optimisation de l'expression de K2 en milieu Algone (fusion ZZ, souche Rosetta

cultivée à 20°C). Analyse SDS-PAGE des fractions soluble (S) et insoluble (I) correspondant

à différentes dilutions du milieu Algone avec de l'eau milliQ (1/3, 1/2, 2/3, et 100 % Algone).

Au vu des résultats de l'optimisation de l'expression de K2 en milieu minimum et milieu riche, il a été décidé de produire la protéine K2 doublement marquée ¹⁵N / ¹³C en milieu Algone dilué au 1/3, et K2 simplement marqué ¹⁵N, en milieu minimum.

1.2) Obtention de K2 simplement marquée ¹⁵N et doublement marquée ¹⁵N / ¹³C

Cette stratégie a été présentée en détail dans le chapitre 4 de la première partie de ce manuscrit. Par conséquent, je me contenterai de rappeler ses points essentiels.

Le plasmide d'expression de ZZ-K2 encode une protéine qui contient, une étiquette de

6 résidus histidine (6xHis), le partenaire de fusion ZZ, le site de reconnaissance TEV (sTEV),

et le domaine K2. La construction obtenue est de la forme 6xHis-ZZ-sTEV-K2 pour un poids moléculaire de 33 kDa. La préparation de l'échantillon débute par la production de plusieurs litres de protéine de fusion. Après lyse des membranes bactériennes et extraction des protéines cytosolubles, les surnageants sont déposés sur colonne d'affinité spécifique au fragment protéique ZZ. Cette étape permet, dans un premier temps, d'éliminer les protéines endogènes de E. coli, puis de cliver le partenaire ZZ par une coupure sur colonne avec la protéase recombinante 6xHis-TEV (produite au laboratoire). Lors de l'élution de la protéine

K2 clivée, le partenaire ZZ est retenu par la résine d'affinité. Une seconde étape de

purification est alors réalisée sur résine de nickel. Contrairement aux protéines résiduelles

6xHis-ZZ-sTEV-K2 et 6xHis-ZZ, et à la protéase 6xHis-TEV, la protéine K2 ne comporte

plus d'étiquette 6xHis après clivage de son partenaire. Elle ne doit donc pas être retenue par la résine de nickel et peut être séparée de la protéase 6XHis-TEV, ainsi que des 2 protéines résiduelles. Au final, les échantillons RMN sont obtenus après concentration sur cellule Amicon.

1.2.2) Production de la protéine de fusion en milieu minimum et milieu Algone

La première étape de préparation des échantillons de protéine K2, enrichie en isotopes

¹⁵N et ¹⁵N / ¹³C, a consisté à produire la protéine de fusion dans 3 L de chaque milieu de culture marqué (milieu minimum marqué ¹⁵N, et milieu Algone doublement marqué ¹⁵N / ¹³C dilué au 1/3). Le protocole d'expression résumé en Figure 2.3 a été préalablement mis au

Figure 2.3 : Protocole de surexpression de K2 en milieu marqué (milieu minimum marqué

La souche Rosetta transformée par le vecteur d'expression encodant la protéine de fusion est étalée sur boîte LB-agar contenant 100 ug/mL d'ampicilline (Ampi) et 20 ug/mL de chloramphénicol (CAM), puis incubée à 37°C pendant 14 heures. Plusieurs colonies sont mises en préculture dans un erlenmeyer de 500 mL contenant 50 mL de LB, 100 ug/mL d'Ampi, 20 ug/mL de CAM, et 0.5 % de glucose. L'ensemble est incubé à 37°C pendant 3 heures sous une agitation de 250 rpm. 100 mL de milieu marqué contenant 50 ug/mL d'Ampi

et 20 ug/mL de CAM sont introduits dans un erlenmeyer de 1 L, puis ensemencés avec un

volume de préculture LB de manière à obtenir une DO initiale à 600 nm égale à 0.1. Cette deuxième préculture est ensuite incubée à 37°C sous agitation (250 rpm) pendant 6 heures.

3 L de milieu marqué contenant 50 ug/mL d'Ampi et 20 ug/mL de CAM sont alors répartis dans 3 fernbachs de 1 L, préchauffés à 37°C, puis ensemencés pour obtenir une DO initiale à

595 nm égale à 0.05. Les cultures d'expression sont ensuite placées à 37°C sous une agitation

de 250 rpm. L'expression de la protéine de fusion K2 est induite par ajout de 1mM d'IPTG dans les milieux de culture lorsque la DO mesurée à 595 nm atteint 1.2. Les fernbachs sont ensuite incubés à 20°C sous une agitation de 250 rpm pendant 14 heures. A l'issu de ce délai,

la croissance bactérienne est stoppée en introduisant les fernbachs de culture dans la glace.

La lyse des cellules procaryotes et l'extraction des protéines ont été menées de la manière suivante. Les bactéries sont récoltées par centrifugation à 2830xg pendant 20 minutes

à 4°C. Après élimination des surnageants, les culots bactériens sont soumis à un cycle de congélation-décongélation dans l'azote liquide. Ils sont ensuite resuspendus dans un tampon Tris contenant, 100 mM de Tris-HCl (pH=8.0), 150 mM de NaCl, 5 % de glycérol, 1 mM d'EDTA, et 1 mM de PMSF. La rupture des membranes bactériennes est réalisée par lyse mécanique en utilisant une presse d'Eaton. 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4, et

0.5 uL/mL de benzonase sont ensuite introduits dans les lysats. Les fractions soluble et

insoluble sont finalement séparées par centrifugation à 40000xg pendant 30 minutes à 4°C.

L'expression soluble de K2 en fernbach a été contrôlée sur gel SDS-PAGE pour chacune des 3 cultures contenant 1 L de milieu marqué, et pour chaque milieu de culture. Comme le montre la Figure 2.4, les niveaux d'expression obtenus sont très satisfaisants en milieu minimum ¹⁵N et en milieu Algone ¹⁵N / ¹³C. Ces profils d'expression sont tout à fait comparables à ceux obtenus lors des tests d'optimisation.

Figure 2.4 : Contrôle de la production de la protéine de fusion K2 sous forme soluble en

milieu minimum marqué ¹⁵N et en milieu Algone ¹⁵N / ¹³C pour chaque litre de culture en fernbach A, B, et C (analyse SDS-PAGE).

La purification de la construction 6xHis-ZZ-sTEV-K2 (ZZ-K2) a été entreprise par chromatographie d'affinité sur résine IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham). Cette résine d'anticorps humains IgG greffés lie de manière spécifique les fragments protéiques de type ZZ. La colonne est préalablement équilibrée avec la solution tampon Tris Saline Tween (TST) contenant, 50 mM de Tris (pH=7.5), 150 mM de NaCl, 0.05 % de Tween 20, 1 mM de PMSF,

et 0.2 mM d'EDTA. Après injection des surnageants de lyse bactérienne, la colonne est rincée plusieurs fois avec du tampon d'équilibration TST jusqu'à retour de l'absorbance mesurée à

280 nm à la ligne de base. La résine est alors resuspendue dans du tampon TST et 2.6 mL de protéase recombinante TEV à 1.8 mg/mL sont introduits dans la colonne. Après une nuit sous agitation à 4°C, la solution de clivage contenue dans la colonne est éluée avec du TST en fractions de 30 mL. L'élution des protéines immobilisées à la résine est menée par introduction de plusieurs volumes d'acide acétique 0.5 M (pH=3.4). Toutes les fractions d'élution sont déposées sur gel d'électrophorèse SDS-PAGE et quantifiées par mesure de l'absorbance à 280 nm sur un spectromètre UV. Le pH des fractions d'acide acétique est préalablement neutralisé avant analyses.

L'analyse SDS-PAGE des fractions de clivage fait apparaître une bande de forte intensité à une masse apparente de 13 kDa (Figure 2.5). Cette masse correspond au poids

moléculaire du domaine K2 (13.6 kDa), ce qui indique que la protéine de fusion a été clivée

par la protéase TEV. Le tampon acide acétique n'étant pas très adapté à la migration sur gel d'électrophorèse, les bandes protéiques des fractions d'élution apparaissent floues et peu intenses. Il est donc difficile de réaliser une observation fine des protéines présentes dans ces fractions et de calculer un rendement de coupure. On peut toutefois observer des nuances de coloration à des masses apparentes qui correspondent au partenaire ZZ clivé (20 kDa), et à la protéine de fusion (33 kDa), ce qui démontre que la coupure sur colonne n'est pas totale.

Figure 2.5 : Purification de la protéine de fusion K2 sur IgG Sepharose et coupure sur

colonne du partenaire ZZ. Analyse SDS-PAGE du surnageant de lyse bactérienne (SN), des fractions de clivage (A et B), et des fractions d'élution à l'acide acétique (EL).

Au final, les rendements obtenus sont très satisfaisants et atteignent, 30 mg/L en milieu minimum, et 25 mg/L en milieu Algone. A l'issu de cette première étape, le degré de pureté de K2 est estimé à 90% bien que quelques bandes contaminantes de faible intensité soient observables dans les fractions de clivage.

La seconde étape de purification de la protéine K2 a été réalisée par chromatographie

de pseudo-affinité sur colonne Ni-NTA Agarose chargée en ions Ni²⁺(Qiagen). La colonne est équilibrée avec un tampon phosphate (50 mM, pH=7.2) contenant, 300 mM de NaCl, 4mM de

â-mercapto-éthanol, et 1mM de PMSF. Les échantillons de K2 en solution dans du TST sont

directement chargés dans la colonne, et plusieurs volumes de tampon phosphate sont

introduits jusqu'à retour de l'absorbance mesurée à 280 nm à la ligne de base. L'élution est

menée par gradient linéaire d'imidazole avec du tampon phosphate contenant de 10 à 500 mM d'imidazole. Les fractions d'élution sont analysées sur gel SDS-PAGE (Figure 2.6) et quantifiées par mesure de l'absorbance à 280 nm.

Figure 2.6 : Purification de K2 sur Ni-NTA Agarose. Analyse SDS-PAGE des fractions

d'élution par gradient linéaire d'imidazole (de 0 à 200 mM). La présence de « traînées » en dessous de la bande correspondant à la protéine K2 sur le gel de droite est due à un problème

L'analyse SDS-PAGE des fractions d'élution fait apparaître que la protéine K2 est retenue par la résine de nickel jusqu'à des concentrations d'imidazole de l'ordre de 30 mM. Sur les 4 histidines que compte K2, les 3 résidus H52, H55, et H57 sont proches dans la séquence primaire. Par conséquent, ce type de fixation non spécifique, à des concentrations d'imidazole relativement faibles, s'explique probablement par la présence d'un amas, contenant ces 3 histidines, situé en surface de K2. Deux bandes protéiques, de masse apparente autour de 30 kDa, sont observables dans les fractions contenant une concentration d'imidazole d'environ 150 mM, et correspondent à la protéase 6xHis-TEV (27kDa), et à la protéine de fusion 6xHis-ZZ-sTEV-K2 (33 kDa).

Les rendements de l'expression du domaine K2 obtenus à l'issu de cette seconde étape

de purification sont très satisfaisants car peu de protéine a été perdue (Tableau 2.2). De plus,

aucune bande contaminante n'est clairement discernable sur l'analyse SDS-PAGE des

fractions de K2. Par conséquent, nous pouvons estimer avoir préparé des échantillons simplement et doublement marqués avec un degré de pureté supérieur à 95%.

Milieu	Milieu Minimum ¹⁵N	Milieu Algone ¹⁵N / ¹³C
A) Rendement IgG	30 mg/L	25 mg/L
B) Rendement final	26 mg/L	22 mg/L

Tableau 2.2 : Rendements de l'expression de K2, après purification sur IgG Sepharose et

coupure sur colonne du partenaire (A), et à l'issu de la 2^ndepurification sur résine Ni²⁺(B).

La dernière étape de préparation de l'échantillon pour l'analyse RMN a consisté à concentrer la protéine à une valeur proche de 1 mM. L'ultrafiltration de K2 a été menée sur cellule Amicon de 10 mL équipée d'une membrane YM3 avec un seuil de coupure de 3 kDa. Afin de réduire la concentration en NaCl et d'éliminer l'imidazole, plusieurs étapes de lavage- concentration ont précédé la concentration finale de K2. A l'issue de l'ultrafiltration, la protéine est en solution dans un tampon phosphate (50 mM, pH=7.0) contenant, 150mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 1 mM de TCEP, et 1 mM de PMSF. L'échantillon RMN est alors obtenu en ajoutant 10% de D2O, 2 mM de TSP, 2 mM de cocktail d'inhibiteurs (SIGMA), et

^{0.01% de NaN}3^{. 600 uL de cette préparation
ont été introduits dans un tube RMN de 5 mm de}

Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

CHAPITRE 2

Production et analyses préliminaires

du domaine K2 de la protéine humaine KIN17

1) Préparation des échantillons pour l'analyse RMN