Etude de l'effet de l'éthylène sur la croissance de champignons filamenteux et la production de leurs mycotoxines associées

Abstract

Raw materials from agricultural crops (cereals, fruits, etc.) are frequently contaminated with filamentous fungi that produce mycotoxins. Among these mycotoxins are aflatoxin B1 and patulin, produced by fungi of the genus Aspergillus and Penicillium, respectively. Due to the proven toxicity of mycotoxins, they constitute a real danger relating to food safety. Until recently, the use of phytosanitary products was privileged to fight against contamination by mycotoxins. However, the toxicity and harmful effects of these products encourage the development of alternative control methods based on the use of natural compounds, such as a phytohormone like ethylene, to reduce contamination by mycotoxins. Some studies, conducted exclusively on the production of aflatoxins by filamentous fungi of the genus Aspergillus, have demonstrated the capacity of ethylene to decrease the production of mycotoxins in this family. Although the way in which fungi perceive ethylene is still unknown and in the case of an effect of ethylene on the production of mycotoxins, the effect of 1-methylcyclopropene (1-MCP), a gas that inhibits plant receptors ethylene, has been tested. The results obtained showed that an ethylene treatment had no influence on the growth of the fungi studied although a general increase in mycotoxins was observed when ethylene is applied without removing the CO2 naturally produced by the fungal species. However, when treated with ethylene with soda lime (CO2 trap), the fungi reacted with ethylene, suggesting the presence of an ethylene receptor, not characterized to date. Moreover, these same results seem promising for the use of ethylene as a biocontrol agent since a significant decrease in the production of mycotoxins has been observed.

Table des matières

I.		Introduction	1
	1.	Les champignons filamenteux	1
	2.	Les genres Aspergillus et Penicillium	2
		2.1. Aspergillus spp	2
		2.2. Penicillium spp	3
	3.	Les mycotoxines, aflatoxines et patuline	4
		3.1. Les mycotoxines, diversité et dangerosité	4
		3.2. Les aflatoxines	6
		3.3. La patuline	7
	4.	Problèmes sanitaires engendrés et réglementation subséquente	8
		4.1. Problèmes sanitaires	8
		4.2. Réglementation	9
	5.	L'éthylène et les fruits climactériques	9
		5.1. L'éthylène, phytohormone du stress	9
		5.2. Les récepteurs à l'éthylène connus	10
	6.	L'éthylène chez les champignons filamenteux	11
		6.1. Effet de l'éthylène sur différentes espèces fongiques	11
		6.2. Potentiel rôle des GPCR dans la réponse à l'éthylène	11
		6.3. Perspective d'utilisation de l'éthylène comme agent de biocontrôle	12
II.		Matériels & Méthodes	13
	1.	Analyses bio-informatiques	13
	2.	Souches, origines des gaz et milieux de culture utilisés	13
		2.1. Souches fongiques et origines des gaz	13
		2.2. Milieux de culture	13
	3.	Préparation des solutions de spores	14
		3.1. Revivification des souches fongiques	14
		3.2. Préparation de la solution de Tween 80 à 0,05%	14
		3.3. Récupération des spores	14
		3.4. Numération à la cellule de Thoma	14
	3.	Préparation des gaz	15
	4.	Ensemencement et conditions de culture	15
		4.1. Ensemencement des boîtes de Pétri	15
		4.2. Injection des gaz	16
	5.	Détermination de la croissance fongique	16
	6.	Extraction des mycotoxines	16
		6.1. Extraction des aflatoxines	16
		6.2. Extraction de la patuline	16
	7.	Dosage des mycotoxines par HPLC	16
		7.1. Préparation des gammes étalon	16
		7.2. Analyse HPLC des aflatoxines	17

7.3. Analyse HPLC de la patuline 17

8. Dosage de l'éthylène par GC 18

8.1. Courbe standard 18

8.2. Analyses GC 18

9. Dosage de CO2 par infrarouge 18

10. Analyses statistiques 18

III. Résultats & discussion 18

1. Analyses bio-informatiques 18

2. Dosage de l'éthylène 19

3. Aspergillus flavus 20

4. Penicillium expansum 22

5. Aspergillus parasiticus 24

IV. Conclusion & Perspectives 25

V. Bibliographie 26

VI. Annexes 35

Liste des figures

Figure 1 - Culture d'A. flavus

Figure 2 - Culture d'A. parasiticus

Figure 3 - Culture de P. expansum

Figure 4 - Structures des molécules de la famille des aflatoxines

Figure 5 - Structure de la molécule de patuline

Figure 6 - Réplicats techniques d'une même concentration d'éthylène injectée en GC

Figure 7 - Mesure de la croissance radiale d'A. flavus avec et sans chaux sodée après 72h d'incubation

Figure 8 - Dosage de l'AFB1, AFB2 et du CO2 chez A. flavus sans chaux sodée après 72h d'incubation

Figure 9 - Dosage de l'AFB1, AFB2 et du CO2 chez A. flavus avec et sans chaux sodée après 72h

d'incubation

Figure 10 - Mesure de la croissance radiale de P. expansum après 72h d'incubation

Figure 11 - Dosage de la patuline chez P. expansum sans chaux sodée après 72h d'incubation

Figure 12 - Mesure de la croissance radiale d'A. parasiticus sans chaux sodée après 72h d'incubation

Figure 13 - Dosage de l'AFB1 et AFB2 chez A. parasiticus sans chaux sodée après 72h d'incubation

Figure 14 - Dosage de l'AFG1 et AFG2 chez A. parasiticus sans chaux sodée après 72h d'incubation

Liste des tableaux

Tableau 1 - Exemples de mycotoxines, d'espèces productrices, de sources et d'effets les plus fréquents

Tableau 2 - Teneurs maximales en Aflatoxines

Tableau 3 - Teneurs maximales en Patuline

Tableau 4 - Concentrations en mycotoxines des différentes gammes étalon utilisées

Tableau 5 - Exemple de dosage de la concentration en éthylène dans les bocaux

Glossaire

AFB1 : Aflatoxine Blue 1

AFB2 : Aflatoxine Blue 2

AFG1 : Aflatoxine Green 1

AFG2 : Aflatoxine Green 2

AFM1 : Aflatoxine Milk 1

AFM2 : Aflatoxine Milk 2

CAST : Conseil de la Science et de la Technologie Agricoles

cAMP : Adénosine MonoPhosphate Cyclique

CIRC : Centre International de Recherche sur le Cancer

CYA : Czapek Yeast Agar

DAD : Détecteur à barrette diode

ETR1 : Ethylène Receptor 1

GC : Chromatographie en phase gazeuse

GPCR : Récepteur Couplé à une Protéine G

HPLC : Chromatographie Liquide à Haute Performance

NCBI : Centre National pour l'Information Biotechnologique

PICA : Protéine Kinase A

PPM : Partie Par Million

1-MCP : 1-MéthylCycloPropène

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I. Introduction

Grâce à leur évolution depuis des millénaires, les micro-organismes appartenant au royaume des champignons constituent un clade très diversifié d'eucaryotes représentant un des plus grands groupes de la biodiversité mondiale actuelle. Ils sont retrouvés dans pratiquement tous les environnements, mais surtout dans les écosystèmes terrestres (Richards et al., 2017 ; Stajich, 2017). Ils participent activement à la transformation de l'environnement en tant que décomposeurs de la matière organique, mais également en se liant à d'autres organismes (plantes, procaryotes, animaux...) permettant la mise en place de relations symbiotiques (Galagan et al., 2005).

Par leur capacité à produire des structures macroscopiques, l'étude des champignons se faisait traditionnellement par des techniques microbiologiques. En effet, elles étaient basées sur la culture fongique ainsi que la caractérisation de structures spécialisées et de leurs effets sur leurs hôtes ou partenaires symbiotiques. Cependant, au cours des dernières décennies, l'avènement des techniques de génomique a permis une évolution considérable en termes de connaissance et de compréhension dans le domaine de la mycologie et de la toxicologie. Ces avancées ont alors mis en lumière un grand nombre de souches fongiques productrices d'un large panel de métabolites secondaires. Parmi ces derniers, certains présentent des propriétés toxiques et sont appelés mycotoxines. Ces dernières représentent aujourd'hui un des problèmes majeurs en matière de sécurité sanitaire des aliments et de préjudices économiques pour les producteurs de denrées contaminées. Pour pallier cela, depuis plusieurs années, le recours à des produits phytosanitaires pour réduire la contamination fongique était encouragé. Cependant, la toxicité de ces produits pour l'Homme, l'animal et l'environnement, conduit progressivement les chercheurs à développer d'autres moyens de lutte tels que l'utilisation d'agents de biocontrôle ou de composés naturels pour réduire la contamination fongique et la production de mycotoxines.

L'objectif de ce stage était d'étudier les potentiels effets de l'éthylène, phytohormone de stress, et de son inhibiteur compétitif, le 1-MéthylCycloPropène (1-MCP), sur la croissance de trois champignons filamenteux, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus et Penicillium expansum et de la production de leurs mycotoxines associées, les aflatoxines et la patuline.

1. Les champignons filamenteux

Les champignons filamenteux, appelés également moisissures, forment un règne à part entière : le règne fongique ou des Fungi (du latin fungus, le champignon). Le terme courant de « moisissure » fait généralement référence à leur texture laineuse/cotonneuse pouvant être observée mais n'a pas de sens phylogénétique étant donné que différentes espèces appartenant à différents phylums (ascomycètes et zygomycètes) sont regroupées sous cette même appellation. Les champignons filamenteux sont des micro-organismes eucaryotes pluricellulaires, ubiquistes et généralement saprophytes ou parasites. Ils sont incapables d'assurer la photosynthèse et se nourrissent par dégradation de molécules organiques présentent dans l'environnement, les qualifiant ainsi d'organismes hétérotrophes. La colonie fongique est constituée d'un appareil végétatif composé de

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filaments appelés hyphes et l'ensemble des hyphes forment le mycélium. Des structures spécialisées au sein du mycélium, appelées « conidiophores », sont responsables de la production de nombreuses spores qui confèrent aux champignons filamenteux un pouvoir de dissémination considérable.

Les moisissures sont des organismes au potentiel encore trop inexploré. En effet, les champignons filamenteux ont la capacité de produire un grand nombre de métabolites secondaires. Contrairement aux métabolites primaires, ces métabolites secondaires ne sont pas indispensables au développement et à la survie de l'organisme. Le rôle de ces métabolites secondaires est encore aujourd'hui source de questionnement. Cependant, quelques hypothèses émergent telle que la facilitation procurée par ces composés dans la colonisation de substrats par le champignon filamenteux dans un contexte de compétition entre micro-organismes (Ballester et al., 2015). Toutefois, l'étude de ces métabolites a montré que ces molécules peuvent être bénéfiques pour l'Homme. En effet, les métabolites secondaires fongiques sont utilisés dans de nombreux domaines tels que :

- Les industries pharmaceutique et médicale : synthèse de médicaments et d'antibiotiques (la
pénicilline par Penicillium chrysogenum ou la céphalosporine par Cephalosporium acremonium).

- L'industrie alimentaire : production de fromages tels que le roquefort (Penicillium roqueforti)

ou le camembert (Penicillium camenberti) (Ropars et al., 2012) ; la production d'acides (citrique et gluconique) utilisés comme additifs alimentaires (Karaffa et al., 2001) ; ou encore dans la synthèse d'enzymes (maltase, dextrinase) capables de convertir le maltose et l'amidon en alcool (Lv et al., 2008).

Cependant, à l'opposé de ces aspects bénéfiques, les champignons filamenteux peuvent également produire des métabolites secondaires néfastes, appelés mycotoxines, représentant un risque pour la santé humaine et animale. Les moisissures toxinogènes sont capables de facilement se développer à partir du moment où les facteurs environnementaux, tels que la température et l'humidité, sont propices à leurs croissance (Paterson, 2006). Elles sont donc en mesure de contaminer un panel très large de substrats alimentaires allant d'aliments d'origine végétale comme les céréales, les fruits et leurs dérivés jusqu'aux aliments d'origine animale tels que le lait, la viande et leurs dérivés (Yiannikouris et Jouany, 2002). De plus, les mycotoxines sont des molécules extrêmement résistantes aux procédés de stabilisation des denrées (pasteurisation, stérilisation), augmentant ainsi leur capacité à perdurer dans la chaîne de production alimentaire (Escrivá, et al., 2017)