6.3. METHODES
6.3.1. PATIENTS
Ving-huit patients (16 hommes et 12 femmes ; âge moyen
47 ans, extrêmes 24 <-- >74 ans) souffrant de cardiomyopathie
dilatée et d'infection VIH stade C2 CDC ont été inclus
dans l'étude d'une manière aléatoire, le tirage au sort se
faisant à partir du registre.
Critères d'inclusion :
- dilatation du VG
- insuffisance cardiaque congestive au stade IV de la NYHA
- critères de l'OMS pour le diagnostic de CMD
(WHO/ISFC, 1980)
- diagnostic de l'infection VIH selon les critères du
CDC (CDC, 1993).
Vingt-huit sujets sains et donneurs bénévoles du
sang ont été sélectionnés de manière
aléatoire à la Banque du Sang de l'Hôpital Mama Yemo,
Kinshasa, pour servir de groupe témoin. Ce groupe témoin
était constitué de 18 hommes et de 10 femmes (âge moyen 44
ans, extrêmes 22 <-> 50 ans).
Nous avons donc constitué à partir de ces sujets
noirs originaires du Zaïre qui ont donné leur libre consentement
deux groupes (avec CMD-SIDA et sans CMD-SIDA).
6.3.2. EXTRACTION DE L'ADN GENOMIQUE
Une méthode de désalinisation
antérieurement publiée (MILLER S.A. et al., 1988) a servi
à la préparation de l'ADN génomique à partir de la
lignée cellulaire B (lymphocytes). La lyse et la digestion du sang ont
été obtenues par le traitement nonionique de détergent
protéinase K comme décrit ailleurs (HIGUCHI R., 1989). Une
méthode alternative a aussi été adaptée pour
l'analyse des échantillons sanguins (SCHWARTZ E.I. et al., 1990).
Dix ìl de sang ont été
étalés sur du papier Whatman de 3mm d'épaisseur dont un
petit morceau de 1 à 2 mm3 de volume a été
coupé et ajouté immédiatement à ce mélange
d'amplification.
6.3.3. TYPAGE DE L'ANTIGENE DRB1
Le typage de l'antigène DRB1 a été
réalisé à partir des échantillons de sang
prélevés dans des tubes contenant de l'EDTA. Les
échantillons ont été typés grâce à des
méthodes de sérologie et de polymorphisme de longueur des
fragments de restriction (RFLP). Cette technique RFLP (restriction fragment
length polymorphism) permet de comparer les ADN de différents individus
et de rechercher si des mutations ponctuelles faisant apparaître ou
disparaître des sites de restriction se sont produites. Deux ADN de
séquence identique traités par des enzymes de restriction
donneront des fragments identiques. Les Southern blots obtenus avec ces
fragments d'ADN seront donc identiques. Au contraire si un site de restriction
a disparu, à la suite d'une mutation ponctuelle, les fragments n'auront
plus des tailles identiques, ce qui sera donc visible sur les auroradiogrammes.
Il en est de même si un nouveau site de restriction est apparu à
la suite d'une mutation. La méthode de l'oligotypage nonisotonique
utilisant l'hybridation de dot blot reverse a été
préférée dans l'étude des allèles DRB1 de la
classe II du HLA. Le second exon polymorphe de différents gènes
a été amplifié par la réaction de la chaîne
polymérase (PCR). La PCR permet d'amplifier la quantité d'ADN
dont on dispose initialement. Il s'agit d'une amplification enzymatique in
vitro. Pour chaque gène, l'hybridation de l'ADN amplifié s'est
déroulée dans des conditions pour les oligonucléotides
(SSOs) spécifiques avec séquences liées aux
membranes, alors que la visualisation des signaux positifs a été
rendue possible par la chimioluminescence. Une combinaison de 11, 18, 23 et de
31 SSOs a été conçue pour identifier le locus
des 50/55 DRB1. Pour le locus de DRB1, une PCR spécifique pour le
groupe DRB 04 a été utililsée en vue d'opérer une
discrimination entre les éventuelles allèles DR4 de
différentes combinaisons hétérozygotes.
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