Effets des extraits de quelques plantes médicinales locales sur les enzymes alpha amylase, trypsine et lipase

2. Quantification des composees phenoliques

2.1. Dosage des phenols totaux

Le principe de ce dosage est adapte par Singleton et Ross (en 1965) avec le reactif de Folin -- Ciocalteu (B.I.GINER-Chavez ,1996).

Le reactif de Folin-Ciocalteu est un acide de couleur jaune, constitue de polyheterocycles acides contenant l'acide phosphotungestique H₃PM₁₂0₄₀ et l'acide phosphomolybdique H₃PW₁₂0₄₀ dont la reaction est :

Oxydation des phenolates --> reduction des polyheterocycles --> formation d'un complexe molybdene(Mo₈0₂₃)-tungstene (W₈0₂₃) stable bleu qui absorbe fortement a une longueur d'onde de l'ordre 760 nm. Le phenol standard utilise dans cette methode est l'acide gallique dont la formule chimique est presentee dans la figure IV. 4.

Figure IV. 4. L'acide gallique (Acide 3,4,5-trihydroxybenzoIque).

2.1.1. La courbe d'etalonnage

A partir d'une solution mere aqueuse preparee de l'acide gallique de concentration massique 0.5 g/1, des solutions filles sont ainsi preparees de concentration allant de 0.06 g/1 jusqu'a 0.28 g/1.

A l'aide d'une micropipette, 100 gl de chaque solution est introduite dans des tubes a essais, suivi de l'addition de 500 gl du reactif de Folin-Ciocalteu (10 fois dilue dans l'eau), apres 2 minutes 2 ml de carbonate de sodium Na₂CO₃ a 20% (m/v) ont ete ajoutes (favoriser un milieu alcalin pour declencher la reaction d'oxydoreduction), par la suite ces solutions sont maintenus a l'obscurite pendant 30 minutes a temperature ambiante. La lecture de l'absorbance de chaque solution est effectuee a l'aide d'un spectrophotometre de Shimadzu 1601 (figure IV .5) a une longueur d'onde de 760 nm contre un blanc (méme solution sans la solution d'acide gallique) ce qui nous permet de tracer la courbe d'etalonnage (figure IV .6).

f -4111111F"'

Figure IV. 5. Le spectrophotometre UV-visible de Shimadzu (1601).

0

0,1

0,2

0,3

co			C
0,8		8
0,6		-E 0
		.c%
0,4
0,2
0

Concentration (g/I)

Figure IV. 6. La courbe d'etalonnage de l'acide gallique.

2.1.2. Traitement des echantillons

Une quantite de 100g1 de chaque solution d'extraits dillies est introduite dans des tubes a essais, l'addition de 500g1 du reactif de Folin- Ciocalteu (10 fois dilue dans l'eau), apres 2 minutes, on ajoute 2 ml de carbonate de sodium Na₂CO₃ a 20% (m/v) afin de favoriser un milieu alcalin pour demarrer la reaction d'oxydoreduction, par la suite ces solutions d'extraits sont maintenus a l'obscurite pendant 30 minutes a temperature ambiante. La lecture de l'absorbance de chaque solution d'extraits est effectuee de la fawn decrite precedemment.

2.1.3. Resultats et discussion

L'analyse quantitative des phenols totaux des extraits phenoliques a ete realisee par la méme procedure decrite precedemment. La teneur en composes phenoliques de chaque extrait de plante a ete alors calculee a partir de la courbe d'etalonnage et exprimee en milligrammes par 100 grammes de la matiere seche equivalent en acide gallique.

Les resultats obtenus sont presentes dans le tableau IV. 2.

Tableau IV.2 : La teneur en phenols totaux des plantes investiguees.

Teneur en

plante C: g/1 polyphenols: mg/100g

Foulia 1,85 370

Gondale 0,18 37

Lelma 1,21 241

Remth 1,10 215

Reguig 1,21 241

Serr 1,10 214

Zwadet Elkhrouf 0,81 162

La teneur en polyphenols dans les plantes etudiees varie de 37mg/100g a 370mg/100g. Remarquons que les quatre plantes renferment presque la méme quantite de phenols totaux. Si on compare nos resultats a ceux déjà realises au laboratoire (M. Yousfi et al, 2006, 2007) on peut dire que les plantes investiguees sont pauvres en composes phenoliques.

Les teneurs en phenols totaux determines par colorimetrie (tableau W. 2) sont toujours tres faibles par rapport aux rendements des extraits bruts (tableau IV. 1), ce resultat indique que l'extrait brut obtenu par extraction liquide- liquide avec de l'acetate d'ethyle contient des composes autres que les polyphenols.

2.2. Dosage des flavondides

La quantification des flavonokles a ete effectuee par une methode adapt& par Zhishen et al (Zhishen et al, 1999) avec le trichlorure d'aluminium et la soude. Le trichlorure d'aluminium forme un complexe jaune avec les flavonokles et la soude forme un complexe de couleur rose absorbe dans le visible a 510 nm. Le flavonokle standard utilise dans cette methode est la catechine dont la formule chimique est represent& dans la figure IV. 7.

Figure IV. 7. La catechine (-)-trans-3,3',4',5,7-Pentahydroxyflavane (Augustin Scalbert, 2004)

2.2.1. La courbe d'etalonnage

A partir de la solution mere de la catechine (utilisee comme &talon pour tracer la courbe d'etalonnage) preparee dans le methanol de concentration massique 1 g/1, on prepare des solutions filles de concentrations allant de 0.1 a 0.8 g/l.

Dans une fiole, on met 1 ml de chaque dilution de solution fille de la catechine (Figure IV.7) ou de l'extrait lors de la quantification des flavonokles, on ajoute 5 ml d'eau distill& puis 0.3 ml de nitrite de sodium NaNO₂ a 5% (m/v) dans l'eau et apres 5 minutes on rajoute 0.6 ml de trichlorure d'aluminium A1C1₃ a 10 % (m/v) dans l'eau, on remarque que les flavonokles reagissent avec lui pour former un complexe jaune. 5 min apres, on additionne 2 ml de la soude NaOH (1M) et on constate le changement de coloration du jaune vers le rose qui absorbe dans le visible a 510 nm. Ceci est complete a 10 ml avec de l'eau distillee, suivi d'une legere agitation afin d'homogeneiser la solution pour la lecture contre un blanc d'eau distill& en employant le méme spectrophotometre ultraviolet. A partir des valeurs des absorbances obtenues, nous avons trace la courbe d'etalonnage de la catechine (Figure IV.8).

I

1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2

y = 2,2272x R² = 0,9974

O

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

concentration (g/1)

Figure IV. 8. La courbe d'etalonnage de la catechine.

2.2.2. Resultats et discussion

La quantification des flavondides dans nos extraits a ete determine en utilisant la courbe d'etalonnage et les resultats sont exprimes en equivalent de la catechine, les resultats obtenus sont consigns dans le tableau W. 3.

Tableau IV.3. La teneur en flavonoIdes et leur pourcentage des plantes investiguees.

plante	C: g/1	Teneur en flavomfides mg/100g		Taux de flavomfides (%)	Foulia
0.72	144	38,91		Gondale
0,127	25	67,56		Lelma
1.32	264	109,12		Remth
0.4	80	36,74		Reguig
0,55	110	45,22		Sen-
0,77	155	72,43		Zwadet Elkhrouf
0,13	26	15,43

Dans toutes les plantes, on remarque que la taux des flavonoIdes est compris entre 15,43 et 72,43% et inferieur aux taux des phenols totaux, sauf pour la plante "Lelma", ce resultat peut étre explique que la plante "Lelma" contient des composes possedant des structures chimiques similaires aux flavondides, ou des flavonoIdes de couleur rose ce qui augmente l'absorbance de l'extrait a 510 nm.

3. Conclusion

Les sept plantes ont subi le méme traitement de sechage et d'extraction comme it est decrit precedemment. La teneur en composes phenoliques et en flavonokles depend de differents facteurs (nature de l'espêce, conditions physiologiques, la genetique, type d'extraction: le solvant, le mode "a froid, a chaud", agitation ou non, ...). Les resultats obtenus aprês les analyses sont résumés dans l'histogramme figure IV. 9.

Teneur Ingig _{3_}

2,5 - 2 - 1 ,5- 1-				1 d t							IiI Phenols (mg/g) Flavonoides (mg/g)
					0						0,5-
								Plantes

Figure IV. 9. La teneur en composes phenoliques et les flavonokles dans chaque plante. Dans la plante "Lelma" le taux des flavonokles est nettement superieur au taux des poly phenols, celui est interprets que peut étre ces composes ont une structure semblable de celle des flavonokles donc ils absorbent dans la méme longueur d'onde.

Bibliographie

· Augustin Scalbert, 1 avril 2004, Fruits et legumes, polyphenols et sante, laboratoire des maladies metaboliques et micronutriments, INRA, Centre de Recherche de Clermont-Fen-and/Theix, relu par Edith Florentin (professeur agregee).

· B.I. Giner-Chavez, 1996, condensed tannins in tropical forages -these Ph. D, Cornell University, Ithaca, USA.

· J. Zhishen, T. Mengcheng, W. Jianming, 1999, the determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals, J Food Chem, Volume 64, pp 555-559.

· M. Yousfi, A. Djeridane, B. Nadjemi, S. Maamri, F. Djireb, P. Stocker, December 2006, Phenolic extracts from various Algerian plants as strong inhibitors of porcine liver carboxylesterase, J Enzyme Inhib Med Chem, Volume 21, No 6, pp 719-26.

· M. Yousfi, A. Djeridane, B. Nadjemi, N. Vidal, JF. Lesgards and P. Stocker, July 2007, Screening of some Algerian medicinal plants for the phenolic compounds and their antioxidant activity, J European Food Research and Technology, Volume 224, No 6, pp 801-809.

Z1 Ids des extraits

p6andires sur (es

enzynes

ai--d Amyrase

Alpha dextrines

Chapitre V: effets des extraits phenoliques sur les enzymes 1. a- Amylase
1. Principe de la methode

L'activite enzymatique peut étre mesuree par differentes techniques physico-chimiques (colorimetrie, spectrophotometrie, fluorimetrie) ; cherchant generalement la disparition du substrat ou l'apparition de produit en suivant l'evolution de la densite optique.

Dans ce travail on s'interesse a l'evaluation de l'effet des composes phenoliques des extraits (des plantes investiguees) sur l'activite (inhibition) enzymatique de l'alpha amylase d'Aspergillus oryzae. Elle hydrolyse l'amidon (il existe sous forme de granules, qui se composent de plusieurs molecules de million d'amylopectine ainsi qu'un nombre encore plus grand de molecules d'amylose (R. Bowen, 2006) en produit principal le maltose incolore suivant cette reaction :

a- amylase

Maltase +

Maltatriase

Figure V. 1. 1. L'action de l'a- amylase sur l'amidon