TLS, une protéine du spliceosome, est impliquée dans le mécanisme d'action de l'acide rétinoà¯que à travers les régulations post-transcriptionnelle et transcriptionnelle

f) Technique de Western Blot

Des extraits protéiques totaux sont réalisés. Les cellules sont lavées deux fois au PBS 1X, le culot est repris dans 300ul de tampon d'extraction (Hepès 20 mM pH 8, NaCl 450 mM, EDTA 0,4 mM et glycérol 25%) contenant des inhibiteurs de protéases (pepstatine, leupeptine, aprotinine). Pour la lyse des cellules, trois bains successifs dans l'azote et à 37°C sont effectués. Après centrifugation (15min. à 14000 rpm), le surnageant correspondant à l'extrait total est prélevé, constitué en fractions aliquotes et congelé à -80°C.

Après une dénaturation de 10 min. à 100^oC, les échantillons de protéines sont déposés sur un gel dénaturant d'acrylamide 12 %. La migration se fait en 2 étapes, tout d'abord à 80 V pendant 15 min. puis à 125 V pendant une heure. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose par électrotransfert à 600 mA pendant 60 min. au froid. Pour utiliser les anticorps anti-RAR et anti-RXR, la membrane est lavée deux fois avec du PBS 1X puis saturée avec du lait 5 % pendant 2 heures à température ambiante. Durant toute la nuit, la membrane est incubée à 4^oC avec l'anticorps primaire anti-RAR dilué au 1/100^è et anti-RXR dilué au 1/100^è. Lavée 5 fois 10 min. avec du PBS 1X, la membrane est re-saturée avec du lait (2,5 %) pendant 10 min. puis incubée avec l'anticorps secondaire pendant 30 min. (Protéine A diluée au 1/10000^è). Puis, 5 lavages sont effectués au PBS 1X contenant 0,01 % de Tween.

Pour l'anticorps anti-myc, la membrane est saturée avec du PBS Tween 20 à 0,1 % pendant 2 heures à température ambiante. Plusieurs lavages au PBS Tween sont faits pendant deux min. La membrane est incubée à 4^oC toute la nuit avec l'anticorps primaire anti-myc dilué au 1/10000^è. Lavée plusieurs fois pendant 5 min. avec 500 ml de PBS Tween, la membrane est incubée avec l'anticorps secondaire pendant une heure (anti-kappa de souris dilué au 1/1500^è). Puis les membranes sont lavées avec 1l de PBS Tween pendant au moins trois fois 15min..

Enfin, la membrane est mise en présence d'une solution de détection (ECL, Amersham, Piscataway, NJ, EUA) durant une minute. La radiographie est faite en exposant un film à des temps variables (Hyperfilm ECL, Amersham, Piscataway, NJ, EUA).

g) Technique du retard sur gel

La sonde DR5, qui correspond à l'élément de réponse RARE du promoteur de RAR, est marquée à son extrémité 5' en incubant pendant 60 min. à 37^oC: 30 ng de la sonde, du tampon kinase 10X, 3 l d'ATPP³², 1 l de T4 polynucléotide kinase (5 unités). Après avoir purifié la sonde marquée sur une colonne (centri.spin-40, préalablement hydratée avec 0,5 ml de tampon TE 1X pendant 30 min. et centrifugée 2 min. à 700 g à température ambiante) en la centrifugeant 2 min. à 700 g à température ambiante, le contrôle de l'activité spécifique est réalisé grâce à un compteur à scintillation. La sonde double brin est élaborée en ajoutant à la sonde marquée 60 ng du brin complémentaire, du tampon kinase 10X et 150 mM de NaCl. La solution est dénaturée à 100^oC puis progressivement refroidie à 37^oC.

Les extraits protéiques et les anticorps sont incubés 20 min. sur la glace avec une solution contenant 2 ul de tampon Darnell (KCl 400 mM, Hepès 200 mM, MgCl₂ 10 mM, EGTA 1 mM, DTT 5 mM, Ficoll 4%, pH 7,5), 1 ul de poly dI-dC (1 ug/ul) et 40000 cpm de la sonde radiomarquée. Les extraits sont ensuite déposés sur un gel de polyacrylamide 4 % et migrés à 200 V durant 82 min. Le gel est séché à vide pendant 120 min à 80°C. Une autoradiographie est réalisée avec un écran amplificateur en présence d'un film Kodak X-Omat AR à -80⁰C durant 12 heures.