III- RESULTATS
1. TLS est un co-activateur du RANC
Premièrement, nous avons analysé l'effet d'une
surexpression transitoire de TLS sur l'expression d'un gène rapporteur
(luciférase) sous le contrôle du promoteur RARß2 (Figure
4A). Nous avons utilisé comme modèle cellulaire les cellules
hématopoïétiques HL-60. Ces cellules sont
électroporées en présence de Tkßgal, pour
évaluer l'efficacité de transfection et normaliser les
résultats, de ßRARE-luc, utilisé comme gène
rapporteur pour évaluer l'activité transcriptionnelle et de
différentes quantités de vecteur d'expression de TLS, comme
indiquées. pCS3, un plasmide contrôle est utilisé de telle
façon que toutes les transfections aient la même quantité
totale de plasmide d'expression (Figure 4). Les cellules sont
récoltées 24 h après et l'activité
luciférase est mesurée. Les valeurs représentent les
moyennes des doublets réalisés. Des résultats similaires
furent obtenus dans plusieurs expériences indépendantes.
Les résultats exprimés correspondant à
l'augmentation de l'activité de la luciférase par rapport
à un témoin négatif (cellules transfectées avec
pCS3 seul, en absence de ligand).
Lors de la transfection en présence d'AR seul (1'), une
augmentation de l'activité luciférase est observée. La
co-transfection par pCS3-MT-TLS seul et RARE-luc (2 et 3) n'a pas d'effet sur
l'induction de l'activité luciférase, sauf en présence
d'AR (ATRA 10-6 M) (2' et 3', multiplié par 25, en
présence de 5 ug et 10 uG de TLS (Figure 4B). Ces résultats
suggèrent que TLS augmente l'activité transcriptionnelle induite
par les récepteurs endogènes dans les cellules HL-60.
Afin de déterminer que la co-activation par TLS agit
par et grâce au RANC, nous avons utilisé des cellules Cos-6
possédant peu de récepteurs aux rétinoïdes
endogènes que nous avons transfectées avec les plasmides
d'expression de RAR et de RXR. Les cellules Cos-6 sont donc
co-transfectées au chlorure de calcium avec les plasmides TKgal et RARE,
comme décrit précédemment.
Figure 4 . TLS augmente l'activité
transcriptionnelle des récepteurs nucléaires à l'acide
rétinoïque dans les cellules HL-60. A, schéma
descriptif de la construction utilisée dans le test de transactivation.
B, L'activation transcriptionnelle du RARE a lieu avec l'AR seul ou avec TLS de
façon dépendante de l'AR dans les cellules HL-60.
Dans la Figure 5, les contrôles (1 et 4) indiquent la
transactivation basale du gène rapporteur. Lors de la transfection en
présence d'AR seul (1' et 4', multiplié par 40) ou avec TLS (2',
3', 5', 6' et 7'), une induction est observée. L'induction est optimale
avec 2 ug de TLS (3' et 5', multiplié par 85). TLS est donc un
co-activateur du complexe transcriptionnel des récepteurs RAR et RXR,
dépendant de l'AR. A des quantités plus importantes, 5 ug et 10
ug de TLS (6' et 7'), une diminution de l'induction en présence d'AR,
inférieure au niveau atteint en absence de TLS, est observée.
Cette diminution pourrait être dû à un effet de
« quenching » ou à l'effet de TLS qui, en grandes
quantités, empêcherait RXR de se lier à l'ADN.
L'ensemble de ces résultats indiquent que la
protéine TLS est un co-activateur de la transcription par les
récepteurs à l'AR. TLS semble donc impliquée dans la voie
de signalisation de l'AR.
Figure 5 A et B. TLS agit comme co-activateur du
RANC, de façon dose dépendante. Les deux
expériences sont réalisées indépendamment.
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