TLS, une protéine du spliceosome, est impliquée dans le mécanisme d'action de l'acide rétinoà¯que à travers les régulations post-transcriptionnelle et transcriptionnelle

b) Préparation de l'ADN plasmidique

L'ADN plasmidique est obtenu par culture de bactéries préalablement transformées par les plasmides d'intérêt, dans du milieu LB plus ampicilline 1X. L'ADN plasmidique est préparé selon le protocole de purification plasmidique (Plasmid Purification, Qiagen). Il subit ensuite une précipitation au chlorure de césium, cette étape augmente la pureté de l'ADN mais n'est pas obligatoire. La qualité de cet ADN est analysée par spectrophotométrie pour évaluer la quantité et par migration sur gel d'agarose 1 % pour évaluer la qualité.

c) Transfections cellulaires

1) Transfection transitoire de cellules Cos-6 par phosphate de calcium

Vingt quatre heures avant la transfection, les cellules sont mises dans des puits de culture de 6 cm de diamètre à une concentration de 600000 dans 5 ml de milieu. Le jour suivant, le milieu est remplacé par 4 ml de milieu frais. Une solution de 1 ml contenant 5 à 30 ug d'ADN plasmidique dans 450 ul de H₂O, 50 ul de CaCl₂ (2,5 M) et 500 ul de HBS 2X (NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na₂HPO₄ 12 mM, Glucose 12 mM, Hépès 50 mM) préalablement incubée 30 min. à température ambiante est ajoutée sur les cellules. Elles sont remises dans l'étuve 12 heures, puis lavées au PBS 1X. Du milieu frais est ajouté et ainsi que le ligand, éventuellement. Les cellules sont de nouveau incubées de 24 heures pour un dosage de la luciférase à 2 jours pour une extraction protéique à 37°C. Avant l'extraction des protéines, les cellules sont lavées au PBS 1X.

2) Transfection transitoire de cellules HL-60 par électroporation

Les cellules sont passées la veille à la concentration habituelle correspondant au type cellulaire et les cuves à éléctroporation sont préalablement refroidies à 4°C. Chaque cuve est utilisée pour 30x10⁶ cellules. Trois heures avant la transfection, les cellules sont mises à 1x10⁶ par ml puis incubées à 37°C. Puis elles sont centrifugées, lavées et regroupées à 4°C dans un volume d'OPTIMEM-1 équivalent à 10 ml pour 100x10⁶ cellules. Elles sont ensuite reprises dans un volume contenant 100 ul d'OPTIMEM-1 par cuve. Après en avoir placé 100 ul dans chaque cuve, le mélange est incubé pendant 10 min. à 4°C. Les cellules sont ajoutées dans les cuves, à une solution plasmidique contenant 100 ul d'OPTIMEM-1 par cuve. L'électroporation est effectuée dans un électroporateur dont les paramètres sont : C= 960 uF et V=250 V, elles sont ensuite mises à incuber à température ambiante pendant 30min. Les cellules sont récupérées avec 1 ml de milieu complet préalablement chauffé à 37°C. Les cellules sont incubées à 37°C pendant trois heures, puis remises en culture.

3) Transfection transitoire de cellules K562 par la lipofectamine

L'ADN plasmidique est préparé dans un volume de 100 ul par puits avec 5 % de lipofectamine plus et complété par 95 ul d'OPTIMEM-1 qui est laissé incubé pendant 15 min. Une solution de 12,5 ul de lipofectamine et de 87,5 ul d'OPTIMEM-1 par puits est préparée. Les deux solutions sont mélangées dans des tubes stériles en polypropylène, en ajoutant la solution plasmidique goutte à goutte. Ce mélange est incubé une heure à température ambiante. Les cellules sont conditionnées au nombre de 2x10⁶ par puits dans 0,8 ml d'OPTIMEM-1 (la concentration initiale des cellules dans leur milieu était de 500000 par ml) et incubées une heure à 37°C. Les 200 ul préparés sont déposés goutte à goutte dans chaque puits. Puis les cellules sont incubées deux heures à 37°C et enfin 3,5 ml de milieu sont ajoutés et le ligand éventuellement.