Chapitre II : Matériel & Méthodes
5. Dosage du monoxyde d'azote (NO) :
L'évaluation des taux de monoxydes d'azote a
été réalisée par le dosage de ses
métabolites physiologiquement stables, les nitrites résiduels
(NO2-). Le dosage du NO a été réalisé au
niveau des plasma et des surnageants de culture cellulaire, par la
méthode de Griess modifiée.
5.1 Principe :
C'est une technique colorimétrique qui permet la
quantification des nitrites (métabolites stables du NO). Ce dosage est
réalisé au spectrophotomètre à une longueur d'onde
de ë=543nm.
5.2 Mode opératoire :
Une courbe étalon des nitrites s'étalant de 0
à 128uM est réalisée antérieurement à partir
d'une solution mère de NaNO2. L'échantillon à doser est
mélangé à 25ìl de Griess B, 25 ul de Griess A et
400 ul d'eau distillée respectivement. La solution obtenue est alors
incubée pendant 15min à l'obscurité puis
centrifugée à 10000rpm pendant 5 minutes. Une lecture de la DO
est réalisée au spectrophotomètre à une longueur
d'onde de ë=543nm.
Nous avons obtenu la courbe suivante :
-0.1
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
20 40 60 80 100 120 140
do
y = 0.0043x - 0.01 R2 = 0.9866
do
Linear (do)
Figure 8: courbe étalon de dosage du NO
selon la méthode de Griess modifiée.
Les échantillons de plasma et de surnageant de culture
ont été préparés selon la méthode de Griess
modifiée. Puis la lecture des DO a été
réalisée a une longueur d'onde de ë=543nm. Les
concentrations des nitrites résiduels sont déterminées
après extrapolation de la valeur de D0 sur la courbe étalon
DO=É [NaNO2] préalablement établie (Touil-Boukoffa et
al.,1998).
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