Chapitre II : Matériel & Méthodes
6. Etude histologique du côlon:
Après avoir sacrifié les souris, le colon est
délicatement séparé de l'intestin grêle à la
limite iléo-caecale. Sa taille est mesurée sur un plan
gradué (caecum replié), puis un fragment de 1cm correspondant au
rectum est coupé à l'extrémité anale. Ensuite, un
fragment de 0.5 à 1 cm est découpé à partir de la
région distale (en amont du rectum), il est lavé au PBS et
conservé dans du formol tamponné à 10% pour l'étude
histologique.
7. Etude histologique :
L'étude histologie se déroule en plusieurs
étapes :
? La déshydratation : la
déshydratation du colon se fait sous agitation par un passage du tissu
dans des bains d'éthanol à des concentrations croissantes.
Deux bains d'alcool 70° de 5 à 10 min chacun Deux
bains d'alcool 90° de 5 à 10 min chacun Trois bains d'alcool
100° de 5 à 10 min chacun
? L'éclaircissement: les fragments
sont ensuite plongés dans trois bains de toluène pendant 10min
chacun.
? L'inclusion dans la paraffine: Les
fragments tissulaires sont plongés dans deux bains de paraffine de 2h
puis 24h dans une étuve thermostatée à 60°c, ensuite
des blocs sont confectionnés grâce à des cassettes et
seront ultérieurement coupés au microtome.
? La réalisation des coupes: les blocs
de paraffine sont coupés à l'aide d'un microtome pour
réaliser des coupes histologique d'une épaisseur de 4um, les
rubans obtenus sont placés au fur et à mesure dans un bain marie
à 37°C et étalés ainsi sur des lames recouvertes
d'eau gélatinée à 0.4%. les lames sont ensuite
placées dans une étuve thermostatée à 37°c
pendant 24h afin de les sécher.
? Le déparaffinage et la réhydratation
des coupes:
Cette étape vient avant l'étape de la coloration
des coupes. Pour cela les lames sont placées pendant quelques secondes
sur une plaque chauffante puis plongées dans un bain de toluène
pendant 3 à 5 min. Lorsque la paraffine est fondue, les coupes sont
réhydratées en les plongeant dans des bains d'alcool
décroissants :
Un bain d'alcool de 100° pendant 2 à 3 min. Un bain
d'alcool de 90° pendant 2 à 3 min. Un bain d'alcool de 70°
pendant 2 à 3 min. Puis on réalise un bain final d'eau
distillée.
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Chapitre II : Matériel & Méthodes
? La coloration des coupes :
L'étape de la coloration est primordiale à fin
de réaliser notre étude histologique, une coloration à
base d'hématoxyline et d'éosine qui nous permettra d'observer les
différentes couches du côlon distal a été
utilisée. Pour cela les lames sont plongées dans de
l'hématoxyline pendant 2 minutes puis lavées à l'eau de
robinet. Elles sont ensuite plongées dans de l'éosine pendant
quelques secondes puis rincées à l'eau distillée pendant 1
minute.
Enfin, les coupes sont déshydratées par passage
dans des bains d'alcool croissants (70°, 90°, 100°) pendant
quelques minutes, suivis de deux bains de xylène.
? Montage des lames :
La dernière étape consiste à recouvrir
les lames par des lamelles en verre et pour cela une goutte de résine de
montage Eukitt® est déposée sur la lamelle
imprégnée de xylène, celle-ci est fixée sur la lame
délicatement en évitant la formation de bulles d'air.
8. Isolement et culture des cellules mononuclées
du sang périphérique (PBMC) des patients atteints des MICI :
Etude de l'effet immunomodulateur de la ML
Dans le second volet de notre étude nous avons voulu
exploré l'effet de la ML sur la production ex vivo du NO. A cet
effet, Les PBMC sont préparées à partir du sang total par
gradient de densité de Ficoll «Histopaque» (1.077 mg/ml, Sigma
Aldrich). Les cellules sont ensuite récupérées et
re-suspendues dans du PBS stérile. Trois lavages sont effectués
avant de procéder au test de viabilité. Ce dernier
réalisé, les cellules sont mises en culture à raison de
106 cellules/ml dans le milieu de culture RPMI-1640 en
présence et en absence de concentrations croissantes d'extrait brut de
la ML (10, 25, 50 et 60ug/ml) et ou de la cytokine recombinante IL-4 (1ng, 10ng
et 100ng).
8.1 Culture des PBMC humaines :
Les PBMC sont mises en culture dans une microplaque de 96
puits à raison de 106cellules/puits et cela en rajoutant le
volume nécessaire de RPMI-1640 contenant 30 mM de L-glutamine et enrichi
par 5% de sérum de veau foetal, 100UI de pénicilline et 0.1 mg/ml
de streptomycine, en présence et en absence de concentrations
croissantes d'extrait brut de ML (10, 25, 50 et 60ug/ml) et ou de cytokine IL-4
(1ng, 10ng et 100ng) pour un volume final de 200ìl. La microplaque est
alors incubée pendant 20h dans une étuve humidifiée,
réglée à 37°C et 5% de CO2.
Après 20h d'incubation les surnageants de culture sont
récupérés et centrifugés pendant 5min à 4000
rpm. Ils sont ensuite conservés à -20°C pour le dosage
ultérieur du NO.
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