Matériel et Méthodes
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Matériel et Méthodes
1. Matériel
1.1.Cadre d'étude
La présente étude a été
réalisée à la plateforme de biologie moléculaire de
l'Institut Pasteur de Côte d'Ivoire de Juin 2018 à Octobre 2018 (5
mois).
1.2. Matériel d'étude
1.2.1. Matériel biologique
Le matériel biologie est constitué de 5
bactériophages provenant de différents sites d'isolement. Il
s'est agi de 2 phages isolés dans les eaux lagunaires (lagune
Ebrié) et de 3 phages isolés des micromammifères. Le phage
T4 a été utilisée comme phage contrôle de cette
étude (Tableau II).
1.2.2. Matériel technique, équipement et
consommables
La réalisation de cette étude a
nécessité l'utilisation de plusieurs appareils et consommables
(Tableau III) qui ont permis de réaliser l'extraction
et la purification du matériel génétique ainsi que
l'électrophorèse en champ pulsé (PFGE).
1.2.3. Réactifs et tampons
Divers réactifs et tampons ont été
nécessaires pour l'étude moléculaire (Tableau IV
et V). De plus, l'eau pure utilisée était de
qualité biologie moléculaire, elle a permis de réduire les
variations du pH du milieu réactionnel. Par ailleurs, les tampons et
réactifs mentionnés dans le tableau IV ont permis la
caractérisation génomique (PFGE), tandis que ceux du tableau V
ont été utilisés pour la concentration des phages,
l'extraction du matériel génétique et la digestion
enzymatique à l'aide des enzymes de restriction (XbaI, XmnI, XhoI) dont
les caractéristiques sont contenus dans le Tableau
VI.
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Matériel et Méthodes
Tableau II: Matériel biologique
|
Phages
|
Origine
|
Année
d'isolement
|
Réference
|
|
p Ebrios
|
Lagune Ebrié
(Cote d'Ivoire)
|
2015
|
Ngazoa-Kakou et al., 2017 ;
Kakou et
al, 2018.
|
|
p A5a
|
Abobodoumé/ Lagune
Ebrié
(Cote d'Ivoire)
|
2017
|
-
N.P
|
|
p M3
|
Décharge Akouedo
(Cote d'Ivoire)
|
2017
|
N.P
|
|
p M7
|
Gbetitapea
(Cote d'Ivoire)
|
2017
|
N.P
|
|
p M11
|
Soko (Cote d'Ivoire)
|
2017
|
N.P
|
|
p T4
|
Univerité Laval
(Canada)
|
1944
|
Szermer-Olearnik et Boratyñski,
2015.
|
N P : Non Publié
Tableau III : Appareils et consommables
|
Désignations
|
Rôles
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|
V' Cônes stériles
(ART®)
|
|
|
V' Tubes Falcon 15 et 50ml
(WVR®)
|
|
|
V' Alcool 70%, Eau distillée
|
|
|
V' Tube eppendorf 1,5 et 2 mL
|
|
|
V' Béchers 500-1000 mL
|
|
|
Consommables
|
|
Extraction et
|
|
V' Bistouris, Embouts
|
purification
|
|
V' Moules (Bio-Rad Laboratories)
|
|
|
V' Réfrigérateur 4°C, Incubateur
à 50°C
|
|
|
V' Bain marie à 54°C,Microcentrifugeuse
|
|
|
V' Spatule stérile, Scalpel
stérile
|
|
|
V' Générateur avec systèmes PFGE
(CHEF-DR III
|
Caractéristion
|
|
Équipements
|
System) (Bio-Rad)
V' Micropipettes et des cones.
|
génomique,
PFGE
|
|
V' Balance électronique de précision
(BEL)
|
|
|
V' Gel Doc Imager (Bio-Rad)
|
|
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Matériel et Méthodes
Tableau IV : Réactifs et tampons du
PFGE
|
Désignations
|
Réactifs
|
Quantité/L
|
|
1.0 M Tris, pH 8.0
|
· Tris [Tris hydroxymethyl aminomethane]
· Ajuster le pH à 8.0
· H2O
|
60.57g
350 ml
500 ml
|
0.5 M EDTA, pH 8.0
|
· EDTA
· Ajuster le pH à 8.0
· H2O
|
93.05 g
500 ml
|
Tris-EDTA (TE) buffer, 1X, (10 mM
Tris and 1 mM EDTA, pH
8.0).
|
· 1M Tris, pH 8.0
· 0.5 M EDTA, pH 8
· H2O
|
1 ml
0,2 ml
100 ml
|
Tris-Borate-EDTA (TBE), Buffer, 5X
(0.45 M Tris borate et
0.01 M EDTA).
|
· Tris base
· Acide borique
· 0.5 M EDTA, pH 8.0
· H2O
|
54 g 27,5 g 20 ml 1 L
|
Tris-Borate-EDTA (TBE), Buffer,
0.5X (45 mM Tris borate et
1 mM
EDTA)
|
· 5X TBE
· H2O
|
200 ml
1 L
|
Phage suspension (PS) Buffer (0.1 M
Tris et 0.1 M EDTA, pH
8.0).
|
· 1.0 M Tris, pH 8.0
· 0.5 M EDTA, pH 8.0
· H2O
|
10ml
20ml
100 ml
|
Plug agarose (1.2% SeaKem Gold
Agarose, 1X TE Buffer).
|
· SeaKem Gold Agarose
· 1X TE Buffer
· Chauffer jusqu'à dissolution puis maintenir
à 50 ?C
|
1.2 g
100 ml
|
Phage lysis (PL) buffer (50mM Tris,
50mM EDTA, and 1% (w/v)
SDS).
|
· 1.0M Tris, pH 8.0
· 0.5M EDTA, pH 8.0
· SDS
· H2O
|
5 ml
10ml
1 g
85ml
|
Protéinase K solution, 20 mg/ml.
|
· Protéinase K
· Sterile nuclease-free water
|
20mg
1ml
|
PFGE agarose (1% SeaKem Gold
Agarose, 0.5X TBE).
|
· SeaKem Gold Agarose
· 0.5X TBE Buffer
· H2O
· Chauffer jusqu'à dissolution et refroidir à
50 ?C
|
1,2 g
120 ml
1 L
|
PBS 1X
|
· Un comprimé
|
500 ml
|
· PFGE low range DNA Marker in
http://www.neb.com/; Catalogue
|
|
agarose plugs (New England Biolabs; Ipswich, MA, No. N0350S),
approximately 0.13-194 kb
|
|
|
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Matériel et Méthodes
Tableau V : Réactifs et Tampons
|
Désignations
|
Fournisseurs
|
Roles
|
|
Bench Top 1 Kb DNA Ladder GeneRuler 1 Kb DNA Ladder Blue 6X
loading dye
Sybr® Safe DNA Gel Strain Ultra TM Agarose
TAE Buffer 10X
|
Promega
Thermo Scientific
Thermo
Scientific
Invitrogèn
Invitrogèn
Promega
|
Réalisation de
l'électrophorèse
standard
|
|
Polyethylene Glycol (PEG) 8000 Phosphate Buffered Saline (PBS)
NaCl (Chlorure de sodium) Alcool Isopropanol 100% Alcool Iso-amylique
Ethanol95%
Acetate de Sodium
Phénol : Chloroforme : Alcool Isoamylique (25 : 24 : 1)
Protéinase K (20 mg/ml) RNase A 4 (mg/ml)
DNase I
|
Promega
Invitrogèn
Promega
Riedl-de Haen
AMRESCO
AMRESCO
Promega
Promega
Roche
|
Concentration des phages et
l'extraction du
matériel
génétique
|
|
XbaI
XmnI
XhoI
Bovine Serum Albumin (BSA)
|
Promega
Promega
Roche
Promega
|
Digestion enzymatique
|
Tableau VI : Les caractéristiques des
endonucléases utilisées
|
Endonucléase
(Source)
|
Sites de restriction
|
Température
|
Temps
d'incubation
|
Origine
|
|
XbaI
(Promega)
|
5'...TCTAG " A...3' 3'...A.?.GATCT...5'
|
37 ° C
|
4 Heure
|
Xanthomonas
badrii
|
|
XmnI
(Promega)
|
5'...GAANN " NNTTC...3' 3'...CTTNN ?. NNAAG...5'
|
37 ° C
|
4 Heure
|
Xanthomonas
campestris pv.
manihotis
|
|
XhoI
(Roche)
|
5'...C " TCGA...3' 3'...G AGCT?.C...5'
|
37 ° C
|
4 Heure
|
Xanthomonas
holcicola
|
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Matériel et Méthodes
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