I.3. Méthodes
Les méthodes de
prélèvement de sang, de traitement, d'analyse des
échantillons et l'analyse statistique des échantillons sont les
points essentiels qui seront abordés dans ce paragraphe.
I.3.1.
Prélèvements de sang et leur traitement
Le sang a été prélevé par ponction
de la veine jugulaire ou de la veine caudale au 1er jour
(J0) de l'insémination sur toutes les vaches à l'aide
des tubes stériles sous vide (de type VENOJECT ND) portant le
nom ou numéro de l'animal. Le sérum a été
séparé après coagulation et centrifugation à 3500
tours par minute pendant 10 minutes au laboratoire d'endocrinologie de l'Ecole
Inter Etats des Sciences et Médecine Vétérinaire de Dakar
(E.I.S.M.V), puis récupéré à l'aide des pipettes
Pasteur et mis dans des tubes à hémolyse et conservés dans
un congélateur à -20° C jusqu'au jour de leur analyse. Une
identification plus complète des vaches (fiche
prélèvement) a été faite et porte notamment sur la
race, la NEC, l'âge, la localité et le type d'exploitation.
I.3.2. Analyses de laboratoire
Pour la période allant de fin mai à mi-juin
2008, des analyses pour la recherche d'anticorps anti Brucella, anti IBR et
anti BVD ont été effectuées au laboratoire de MIPI
(Microbiologie Immunologie Pathologie Infectieuse) de l'EISMV.
a) Test de dépistage de la Brucellose
Dans le cadre du dépistage de la Brucellose, les
sérums ont été soumis à deux épreuves
sérologiques:
Tous les sérums (132) ont été soumis au
test de Rose Bengale (Epreuve à l'antigène tamponné: EAT)
et à cause de l'insuffisance des réactifs, seulement 88
sérums ont été analysés avec le test ELISA
compétitive.
· Le test au rose Bengale : Il
s'agit d'une épreuve sérologique de diagnostic rapide de la
brucellose réalisée, sur plaque d'opaline, sur des sérums
purs non chauffés. Nous avons laissé 30 minutes avant l'emploi et
à la température de laboratoire (23°C) les sérums
à examiner et la quantité d'antigène nécessaire
pour les examens. Sur les plaques d'opaline, on dispose côte à
côte deux gouttes d'un volume égal : 25ul de sérum
à tester et une goutte (25 ul) d'antigène acide, tamponné
et coloré. L'acidification permet l'élimination des
réactions antigéniques croisées (ANDRE,
1971). A l'aide d'un bâtonnet nous avons mélangé
soigneusement l'antigène et le sérum (un bâtonnet par
sérum), puis agité lentement ce mélange pendant 4
minutes.
La lecture se fait après 4 minutes d'agitation. En
l'absence totale d'agglutination, le sérum est considéré
comme négatif. Lorsqu'on observe une agglutination même minime le
sérum est considéré comme positif.
· Le test ELISA compétitive : Il
se fait selon la procédure décrite dans le kit BRUCELLA-Ab
C-ELISA de SVANOVIR TM
La procédure de la manipulation est
détaillée dans l'annexe II.
Ø Principe du test
La méthode d'ELISA compétitive SVANOVIR
TM utilisée pour la recherche des anticorps anti
Brucella abortus et melitensis est un test multi spécifique
permettant la détection des anticorps spécifiques anti brucella
aussi bien chez les animaux domestiques que sauvages. Chez les bovins, ce test
est capable de distinguer les animaux infectés de brucellose, des
animaux vaccinés contre la Brucellose avec la souche 19 et des animaux
infectés par les bactéries gram négatif responsables des
réactions croisées. Ce test a été
développé de façon à comparer ses performances
avec celles du test de Fixation du complément. Le protocole est celui
d'ELISA compétitive sur phase solide. Les microcupules sont
sensibilisées avec de l'antigène Brucella. Les anticorps
spécifiques anti Brucella présents dans les
sérums testés inhibent la fixation du conjugué anti
Brucella marqué à la péroxydase de Raifort. La
fixation du conjugué est révélée par un substrat
enzymatique et quantifiée par l'apparition d'une coloration
résultant de la conversion du substrat par le conjugué.
Le conjugué non lié est enlevé par
rinçage avant l'ajout de la solution de substrat. L'absorbance ou
densité optique est mesurée au lecteur ELISA à une
longueur d'onde de 450 nm.
Ø Lecture et interprétation
En absence des anticorps anti brucelliques dans le
sérum (Séronégativité), l'anticorps monoclonal se
lie à l'épitope O-LPS de l'Ag S-LPS ce qui se traduit par
l'apparition d'une coloration.
Si le sérum testé contient des Acs
antibrucelliques spécifiques (séropositivité), ces
derniers entrent en compétition avec les Acs monoclonaux sur les sites
de l'épitope et inhibent la liaison des Acs monoclonaux sur la fraction
O-polysaccharide de l'antigène S-LPS et en conséquence le
développement d'une coloration.
Les sérums issus des bovins vaccinés avec la
souche 19 n'entrent pas en compétition avec les Acs monoclonaux à
cause de leur spécificité et faible affinité ce qui
conduit à des réactions négatives.
Cependant, dans certains cas, des échantillons
récoltés dans les 6 mois après la vaccination peuvent
réagir positivement.
Dans le cas du test C-ELISA, avant de conclure quant au statut
de chaque échantillon, il faut vérifier la validité du
test.
Critères de validité du test
Pour s'assurer de la validité du test, les valeurs des
témoins doivent se trouver dans les intervalles suivants :
Densité optique du Contrôle Conjugué
(DOCC ) :0,75-2,0
Pourcentage d'Inhibition du témoin positif
(PITP) :85-110
Pourcentage d'Inhibition du témoin faiblement
positif (PITFP) :30-60
Pourcentage d'Inhibition du témoin
négatif(PITN) :(-10)-15
Avec PI=100-[(Moyenne des DO
échantillon/témoin*100)/ (Moyenne des
DO CC)]
En cas de test invalide, on incrimine la technique et on
doit répéter l'analyse. Si le test est jugé valide, le
statut de l'échantillon testé est déterminé comme
suit :
PI Statut
< 30% Négatif
= 30% Positif
Dans notre travail, un sérum est déclaré
positif s'il répond positivement au moins à l'une des deux
méthodes utilisées (EAT et ELISA).
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