Memoire Online - Thermorésistance de trois serotypes de salmonella dans l'oeuf et les gesiers de poulets

La recherche de Salmonella a été faite en 4 étapes selon la norme ISO 6579: le pré-enrichissement, l'enrichissement, l'isolement et enfin l'identification.

La prise d'essai (10g) de gésier cuit est directement mise dans 90 ml d'eau peptonée tamponnée, puis placée à l'étuve à 37°C pendant 20 heures. Ceci permet aux salmonelles (éventuellement présentes) de se multiplier en abondance ; elles deviennent ainsi facilement détectables par la suite.

Le pré-enrichissement permet la croissance des salmonelles soumises à un stress ou endommagées par des facteurs comme l'exposition à la chaleur, la congélation, la déshydratation, les agents de conservation, une forte pression osmotique ou d'importantes fluctuations de température (Andrews, 1989; D'aoust, 1989).

Dans 10 ml de bouillon de Rappaport de Vassiliadis contenus dans chaque tube à vis stérile, nous mettons 0,1 ml de subculture à l'aide d'une pipette stérile. Les bouillons sont ensuite incubés à l'étuve à 42°C pendant un temps de 18 à 24 heures. La sélectivité du bouillon et la température d'incubation relativement élevée entraînent l'élimination d'une grande partie de la flore d'accompagnement et favorisent la croissance des salmonelles.

Deux géloses sélectives ont été utilisées : les géloses SS et Hektoen. Elles sont ensemencées par technique de stries d'épuisement à partir d'un même bouillon d'enrichissement et mis en incubation à l'étuve 37°C.

Après 24 heures, les colonies isolées sur les géloses présentant les caractéristiques macroscopiques des salmonelles (colonies incolores à centre noir sur SS et colonies verdâtre ou bleuâtres à centre noir sur Hektoen) sont repiquées sur gélose ordinaire pour être soumises à une identification plus fine. Pour chacune des deux géloses cinq colonies caractéristiques sont prélevées pour l'identification.

L'identification des souches de salmonelles fait appel à une sélection biochimiques des isolats analysés, en fonction de réactions biochimiques déterminantes; et à une identification sérologique.

Cette identification est rendue possible, après avoir vérifié que les souches en question sont réellement des Entérobactéries.

Pour cela, nous avons réalisé un repiquage de cinq colonies suspectes, sur de la

Ces souches sont cultivées sur gélose ordinaire (gélose PCA) que nous avons mis à incuber 24 heures à 37°C.

Nous avons par la suite effectué la coloration de Gram et l'observation de l'état frais en vue d'obtenir les caractères majeurs des Entérobactéries.

La coloration de Gram est une technique qui permet de mettre en évidence les caractères morphologiques (forme et taille) des bactéries.

v Dans un premier temps, les bactéries sont colorées en violet par un colorant basique tel que le violet de gentiane puis par une solution de lugol (mordançage).

v Dans un deuxième temps, qualifié de temps de différenciation, les bactéries sont soumises à l'action de l'alcool ou d'un mélange alcool + acétone. Les bactéries se répartissent en deux catégories : celles qui conservent la coloration violette et qui sont qualifiées de bactéries à Gram positif et celles qui sont décolorées et qui sont appelées bactéries à Gram négatif.

v Dans un troisième temps, afin de mieux visualiser les bactéries décolorées, on procède à un traitement par la fuchsine ou par la safranine. Les bactéries à Gram positif apparaissent alors violettes et les bactéries à Gram négatif se recolorent en rouge ou en orange.

Le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après ce temps de coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi, riche en lipides, laisse passer l'alcool (ou le mélange alcool + acétone) qui décolore le cytoplasme alors que, chez les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool et le cytoplasme demeure coloré en violet.

Pour ce faire, nous avons réalisé des frottis avec chacune des colonies suspectes, sur des lames propres.

Sur ces frottis, nous avons ajouté le violet de gentiane que nous avons laissé reposer pendant 2 minutes. Après ces 2 minutes, nous avons rincé les lames à l'eau de robinet. Par la suite, nous avons recouvert les différentes lames de quelques gouttes de Lugol que nous avons laissé reposer pendant 45 secondes. Après avoir renversé le Lugol, nous effectuons la même opération avec l'alcool. Enfin, nous ajoutons quelques gouttes de fuschine sur les frottis, que nous laissons aussi reposer pendant 2 minutes.

La lame est observée après rinçage à l'eau de robinet, et séchage à la flamme.

L'observation se fait au microscope optique, à l'objectif 100, après ajout de quelques gouttes d'huile à immersion sur les différents frottis.

Toutes les souches suspectées et observées sont de petits bacilles à coloration rouge ou orange caractérisant les bactéries Gram négatif (bg^-).

L'état frais est une étape qui permet de mettre en évidence le type de mobilité et la forme des bactéries.

Pour cela, nous avons ensemencé un bouillon ordinaire (bouillon Müller Hinton) que nous avons incubé pendant 24 heures à 37°C.

Une goutte de ce bouillon est déposée à partir d'une anse de platine, sur une lame porte-objet et recouverte par une lamelle couvre-objet et l'observation est faite au microscope optique avec les objectifs (10 puis 40).

La souche de Salmonella sp peut être confondue avec certaines Entérobactéries, de par la similitude de certains de leurs caractères biochimiques. Ce sont Citrobacter, Edwarsiella tarda, Proteus vulgaris et mirabilis.

Pour éliminer donc ces souches proches des salmonelles des tests de présomption sont effectuées, dans le but d'identifier les caractères de genre des Salmonella sp.

Pour effectuer cette identification du genre nous avons ensemencé une mini galerie de 4 milieux d'identification, à savoir: le milieu Kligler-Hajna, le milieu urée-indole, le milieu au glycérol et le milieu «LDC» à la lysine de Taylor.

Nous avons introduit environ 1 ml de ce milieu dans un tube à hémolyse stérile.

Par la suite nous l'avons ensemencé avec une souche pure, prélevée sur gélose Hektoen. Après incubation à 37°C pendant 24 heures, une lecture est faite.

La couleur du milieu reste inchangé pour les souches suspectes, et sont dites uréase négative (non productrices d'uréase). Dans le cas contraire, il vire au rose.

Pour la mise en évidence de la production d'indole, nous avons ajouté quelque goutte du réactif de Kovacs dans les tubes du milieu urée-indole. La dégradation du tryptophane est marquée par l'apparition d'un anneau jaune, pour les salmonelles qui sont dites indole négatif. Dans le cas contraire, nous avons un anneau rouge.

Nous avons ensemencé la gélose à partir du milieu urée-indole, par piqûre centrale dans le culot et par stries d'épuisement au niveau de la pente, avec une suspension de bactérie suspecte. Les tubes sont mis à incuber à 37°C pendant 24 heures.

Après 24 heures d'incubation à 37°C, la coloration verte reste inchangée pour les souches de Salmonella qui sont dites glycérol négatif.

Nous devrions ensemencer ce milieu, en anaérobiose dans des tubes à hémolyse, à partir des mêmes souches pures suspectées; et incubés à 37°C à l'étuve pendant 24 heures.

La coloration reste inchangée pour les souches de Salmonella, et sont dites Lysine décarboxylase positive (LDC+).

En effet la bactérie fermente le glucose dans un premier temps, ce qui acidifie le milieu (virage du violet au jaune). Dans un second temps, la salmonelle qui possède une décarboxylase se met en action ; et les métabolites formés à partir des aminoacides alcalisent le milieu, qui fait virer l'indicateur de pH au violet (formation de la cadavérine à partir de la lysine).

Les résultats des caractères biochimiques vont nous permettre de confirmer si l'Entérobactérie analysée est une salmonelle ou pas (tableau I et II).

Milieux	Caractères biochimiques	Salmonella non typhiques	Salmonella typhiques
			S.Typhi	S.Paratyphi A
Milieu Hajna- Kligler	Glucose	+	+	+
	Gaz	+	-
	H₂S	+	+ (faible)	-
	Lactose	+/-	-
Milieu urée-indole	Uréase	-	-
	Indole	-	-
Milieu glycérol	Glycérol	-	-
Milieu LDC	LDC	+	+

Tableau II: caractères différentiels d'avec les bactéries de la tribut H₂S⁺gaz⁺

souches	Uréase	Indole	Glycérol	LDC
Salmonella non typhique	-	-	-	+
Citrobacter	-	-	+	-
Edwarsiella tarda	-	+		+
Proteus mirabilis	+	-		-
Proteus vulgaris	+	+		-

Thermorésistance de trois serotypes de salmonella dans l'oeuf et les gesiers de poulets

II-2-2-Méthode de recherche de Salmonella