Chapitre II : Matériel et méthodes
3.2. Composition des mix et programmes PCR
Les réactions PCR ont été conduites selon
les protocoles de Briddon et al. (2002), Bull et al. (2003)
et Delatte et al. (2005). Pour les deux couples d'amorcesVD360/CD1266
et Beta01/Beta02, la composition des mix PCR a été conforme aux
indications des auteurs ci-dessus et est consignée dans les tableaux VI
et VII ci-dessous :
Tableau VI: Composition du Mix PCR pour la
détection des Begomovirus
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Réactifs
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Volume pour une réaction (pd)
|
Conc.
Initiale
|
Conc. finale
|
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ADN
|
2
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|
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VD360
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1
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10 uM
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0,5 uM
|
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CD1266
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1
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10 uM
|
0,5 uM
|
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H2O qsp 20
|
13
|
|
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Taq Polymerase (Hot firepol)
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3
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5U/ul
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1U
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Vol total mix
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20
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Tableau VII: Composition du Mix PCR pour la
détection des Betasatellites
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Réactifs
|
Volume pour une réaction (pd)
|
Conc.
Initiale
|
Conc.
Finale
|
|
ADN
|
2
|
|
|
|
Beta 01
|
1
|
10 uM
|
0,5 uM
|
|
Beta 02
|
1
|
10 uM
|
0,5 uM
|
|
H2O qsp 20
|
13
|
|
|
|
Taq Polymerase (Hot firepol)
|
3
|
5U/ul
|
1U
|
|
Vol total mix
|
20
|
|
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Pour la réalisation de la PCR proprement dite, nous
avons utilisé des tubes de 0,2 ml dans lesquels nous avons
préparé nos mix PCR composés des éléments
listés dans le tableau VI et VII et 5. L'amplification a
été effectuée à l'aide d'un thermocycleur (figure
12). Le programme d'amplification était le suivant :
Le programme PCR du couple d'amorces VD360/CD1266 est le suivant
:
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Chapitre II : Matériel et méthodes
35 cycles
95°C pendant 12 min pour la dénaturation initiale
94°C pendant 30s pour la dénaturation 55°C
pendant 30s pour l'hybridation 72°C pendant 1min pour
l'élongation
72°C pendant 10min pour l'élongation finale
Le programme PCR du couple d'amorces Beta01/Beta02 est le suivant
:
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95°C pendant 12 min pour la dénaturation initiale
94°C pendant 1 min pour la dénaturation 54°C pendant 1 min
pour l'hybridation 72°C pendant 1 min 30s pour l'élongation
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35 cycles
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72°C pendant 10 min pour l'élongation finale
Figure 12: Thermocycleur 2720 (Applied
Bioystems) utilisé pour l'amplification (Photo Akakpo, 2019)
4. Analyse des produits de la PCR 4.1. Préparation
du gel
Afin de vérifier l'efficacité des
amplifications, les produits de la PCR ont été analysés.
À cet effet, un gel d'agarose (sigma grade biologie moléculaire)
à 1% (p/v) a été préparé dans du tampon TAE
0,5X (Tris base, acide acétique glacial, EDTA 0,5M pH 8). La
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Chapitre II : Matériel et méthodes
préparation a été faite comme suit : 1 g
d'agarose a été additionné à 100 ml de tampon TAE
0,5X (Tris base, acide acétique glacial, EDTA 0,5M pH 8). Le
mélange a été porté au micro-onde afin de
solubiliser la solution. 4ul de bromure d'éthydium (BET) ont
été incorporées au gel. Le mélange a
été coulé sur un support de gel pour
l'électrophorèse. Un peigne formé de 13 dents a
été préalablement placé sur le support afin de
former 13 puits. Le gel a été laissé à
température ambiante pour gélification.
4.2. Électrophorèse et visualisation
Après gélification, le gel a été
plongé dans une cuve d'électrophorèse contenant du tampon
TAE 0,5X (Tris base, acide acétique glacial, EDTA 0,5M pH 8) de sorte
à immerger totalement le gel dans la cuve. Une quantité de 12,5
ìl des produits d'amplification a été
prélevée à l'aide d'une micropipette et
déposée dans les puits du gel d'agarose à 1%. Dans le
premier puits, a été déposé le marqueur de poids
moléculaire 100 paires de bases DNA ladder (Solis BioDyne) afin de
servir de référentiel pour mesurer la taille de nos bandes. L'eau
(H2O), un témoin positif constitué de l'ADN du manioc
infecté par le ACMV (African cassava mosaic virus) et un
témoin négatif constitué de l'ADN du manioc non
infecté par un Begomovirus ont été également
déposés dans les trois derniers puits. La migration
électrophorétique a été faite à 100 volts
pendant 35 minutes. La visualisation a été faite à l'aide
d'un transilluminateur UV (figure 13).
Figure 13: GEL DOC Major Science (ms) UVDI
utilisé pour la visualisation (Photo Akakpo, 2019)
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