Diversité des begomovirus infectant le gombo au Togo

Chapitre II : Matériel et méthodes

5. Séquençage de certains produits PCR

En vue de séquencer les produits PCR après les tests de diagnostic, 12 échantillons ont été sélectionnés sur la base de la diversité puis amplifiés. Les réactions d'amplification ont été conduites dans un volume final de 40 ul. Après l'amplification, 10 ul des produits PCR ont été mélangés avec 1ìl de tampon bleu de charge (0,040 % bromophénol, 7% glycérol, 6 mM EDTA) puis déposés sur le gel d'agarose (1 %) afin de vérifier la taille des amplicons. Les 30 ul restants ont été dosés à l'aide d'un Nanodrop pour s'assurer que la concentration finale est supérieure ou égale à de 50 ng/ul (concentration indiquée par le compagnie de séquençage). Les produits ont été envoyés à la compagnie Macrogen Europe (Pays Bas) pour le séquençage.

6. Analyses statistiques et phylogénétiques 6.1. Analyses statistiques

Le logiciel Microsoft Excel version 2013 a été utilisé pour les calculs de moyennes, de la prévalence de la maladie de l'enroulement foliaire du gombo et pour la construction des graphiques. Les pourcentages sont calculés en appliquant la formule suivante :

6.2. Analyses phylogénétiques

Pour mieux comprendre les informations obtenues, différents programmes bioinformatiques ont été utilisés. Les fragments de séquençage appelés "contigs" issus du séquençage, ont été édités et assemblés à l'aide du logiciel Geneious 10.2.3. Après obtention des séquences consensus, l'algorithme BLASTn du site NCBI ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) a été utilisé pour la recherche de l'identité des virus par comparaison à des séquences existantes dans des banques de données nucléotidiques (GenBank-EMBL-DDBJ). À travers le même site, nous avions procédé à la recherche de séquences proches des nôtres pour la construction de l'arbre phylogénétique. Le RDP 5.3 a été utilisé pour sélectionner les séquences d'intérêt. Le logiciel MEGA X 10.0.5 a servi à l'alignement des séquences obtenues et à la construction de l'arbre phylogénétique selon la méthode du maximum de vraisemblance (Maximum Likelihood method). Les arbres phylogénétiques ont été construits par le logiciel avec 1000 répétitions de bootstrap. Le logiciel FigTreev1.4.3 a été utilisé pour la visualisation de l'arbre et le logiciel Inkscape 0.92.4 pour l'édition des noms des espèces virales sur l'arbre.