3.1.11.3 Mise en Culture
Les deux écouvillons qui contiennent
l'échantillon sont ensemencés sur une gélose au sang de
mouton, EMB, Sabouraud Chloramphenicol, Gélose nutritive (GN) et une
gélose chocolat(OXOID).
Les boites de GN, EMB et Sabouraud Chloramphenicol sont
incubées à l'étuve à 37°C pendant 18 à
48h. La gélose au sang et la gélose chocolat sont d'abord mises
dans une jarre en atmosphère enrichi de 5 à 10% de CO2 et ensuite
incubées à l'étuve à 37°C pendant 18 à
48h.
3.1.11.4 Identification
L'identification repose sur l'aspect des colonies sur la
gélose et l'hémolyse autour des colonies sur gélose au
sang pour les Streptocoques Béta-hémolytiques.
Examen direct après culture
Celui-ci inclus toujours l'état frais et la coloration
de Gram. Il a été réalisé pour apprécier la
mobilité et la morphologie des bactéries. La coloration de Gram
après culture est faite pour voir la disposition des bactéries
(en amas, en chainette, isolé ou en double) et leur coloration :
violette (Gram positif) et rose (Gram négatif).
A- Pour les cocci : Bactéries à
Gram positif apparaissant en chainette (courte ou longue) ou en amas.
Le test à la catalase sur lame est
réalisé pour départager les Staphylocoques (catalase
positive) et les Streptocoques (Catalase négative)
Le test à la catalase
C'est une enzyme qui décompose l'eau
oxygénée ou peroxyde d'hydrogène (toxique pour certaines
bactéries) en eau et en oxygène gazeux.
Portage vaginal et profil de sensibilité du
Streptococcus agalactiae aux antibiotiques chez la femme enceinte à
HGOPY
-Technique : Nous avons déposé
une goutte d'eau oxygénée à 3% sur une lame propre et
ensuite prélevé une colonie que nous avons déposée
sur la goutte d'eau oxygénée. La lecture est immédiate. La
présence des bulles d'air visible à l'oeil nu signe la
présence de l'enzyme. Les Streptocoques sont catalase négative
alors que les Staphylocoques sont catalase positive.
Remarque : Nous avons utilisés les
bactéries qui ont poussées sur autre géloses que la
gélose au sang à cause de l'action catalasique
de l'hémoglobine donnant un résultat faussement positif.
1. Les Streptocoques :
Les cocci catalase négative sont repiqués dans
une gélose chocolat et une gélose au sang pendant 18 à 24h
pour la suite de l'analyse (groupage par le test au latex, le Camp test et
l'antibiogramme s'il s'agit des SGB)
a) Le groupage par le test au latex :
Nous avons utilisé le PASTOREX STREP kit de BIO-RAD
pour identifier les différents groupes des Streptocoques
beta-hémolytiques groupables selon Lancefield : A, B, C, F, G et D.
- Préparation des extraits
~ 5 à 10 colonies des SGB ont été
prélevées et mises dans un tube
à hémolyse
contenant 300 ul de solution d'extraction enzymatique ;
~ Le mélange est incubé à 37°C
pendant 15 minutes en l'agitant
toutes les 5 minutes.
- Identification
~ chaque flacon est agité pour remettre en suspension
les
particules de latex ;
~ une goutte de chaque latex est déposée dans les
cercles de la
carte d'agglutination.
~ A l'aide d'une pipette, une goutte d'extrait a
été déposée
dans chacun de ces cercles ;
Portage vaginal et profil de sensibilité du
Streptococcus agalactiae aux antibiotiques chez la femme enceinte à
HGOPY
~ le contenu de chaque cercle est
homogénéisé à l'aide d'un
bâtonnet que nous avons changé pour chaque
réaction ;
~ la carte est agitée selon un mouvement orbital pendant
une
minute maximum et le résultat est observé à l'oeil
nu.
Résultat : La formation des
agglutinats rouge sur fond vert au niveau de l'un des cercles signe un
résultat positif. L'absence d'agglutination avec l'un des
réactifs déposé dans les cercles est noté
Streptocoque non groupable.
Les souches ayant agglutinées avec le réactif B
sont soumis à une épreuve de CAMP test.
b) Le CAMP test
Nous avons réalisé l'épreuve d'abord sur
une gélose Columbia enrichie de 5% d'érythrocytes de mouton,
ensuite sur une gélose au sang avec comme base le Blood Agar Base et
enfin sur une gélose nutritive supplémentée de 5% de sang
de mouton.
La souche de Staphylococcus aureus est
ensemencée sous forme d'une strie qui traverse la boite en allant par le
centre. La souche du Streptocoque B à tester est
ensemencée selon une strie perpendiculaire à l'ensemencement du
Staphylococcus aureus et qui s'arrête à 0.2 cm de
celle-ci. Nous avons utilisé d'abord une souche de Staphylococcus
aureus ATCC 25923 et ensuite une souche de Staphylococcus aureus
isolée au laboratoire.
Les boites sont d'abord incubées en atmosphère
normale à 37°C pendant 18 à 24h, puis en atmosphère
enrichie de 5 à 10% de CO2 pendant 24h,
2. Les Staphylocoques :
Les colonies des Staphylocoques sont des cocci en amas,
catalase positive. Le diagnostic d'espèce est réalisé
à l'aide des certains test biochimiques : Ensemencement sur milieu
Chapman (fermentation du mannitol), Coagulase, Oxydase et DNase.
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