Memoire Online - Etude du pouvoir coagulant et antioxydant de l’artichaut sauvage et de l’artichaut cultivé au maroc

Les métabolites secondaires végétaux sont des molécules essentielles à la vie des plantes et leur interaction avec l'environnement. Ils sont également des sources importantes pour les produits pharmaceutiques, les additifs alimentaires et les arômes.

La concentration de ces molécules dans les différentes parties des plantes est influencée par plusieurs facteurs environnementaux tels que la température, l'humidité, l'intensité lumineuse, l'eau, les sels minéraux et le CO2 (Ramakrishna et Ravishankar, 2011). A titre d'exemple, Gengmao et al., (2015) ont observé que l'effet du stress salin est hautement significatif sur la concentration des flavonoïdes (métabolites secondaires) au niveau des feuilles du carthame (Figure 12) (Roumeissa et Maya, 2015; Rachedi et al., 2018).

Figure 12. Effet du stress salin sur la concentration des flavonoïdes au niveau des
feuilles du carthame (Roumeissa et Maya, 2015)

Les composés phénoliques sont des substances présentes dans tous les végétaux et dans tous les organes de la plante. Ils possèdent un noyau aromatique portant un ou plusieurs groupements hydroxyles (Roumeissa et Maya, 2015).

Les composés phénoliques jouent un rôle essentiel dans la structure et la protection des plantes (Stalikas, 2007). Ils offrent également, pour la santé humaine, une protection contre certaines maladies impliquant un stress oxydatif, comme les cancers et les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives (Sun et al., 2011).

Les polyphénols sont caractérisés par la présence d'au moins un noyau benzénique auquel est directement lié au moins un groupe hydroxyle, libre ou engagé dans une autre fonction : éther, ester, hétéroside (Boubekri, 2014a).

Les flavonoïdes constituent un groupe de plus de 6000 composés naturels qui sont quasiment universels chez les plantes vasculaires. Ils constituent des pigments responsables des colorations jaune, orange, et rouge de différents organes végétaux. Tous les flavonoïdes possèdent la même structure de base (C6-C3-C6), ils contiennent quinze atomes de carbone dans leur structure de base: deux cycles aromatiques A et B à six atomes de carbones (Figure 13) liés avec une unité de trois atomes de carbone qui peut ou non être une partie d'un troisième cycle C (Boubekri, 2014a).

Les flavonoïdes jouent un rôle très important dans la croissance des plantes, la floraison, la fructification et la défense contre les maladies et les microorganismes. Ils ont également un rôle très important pour la santé humaine. A titre d'exemple, ils sont efficaces pour l'inflammation chronique, les maladies allergiques, les maladies coronariennes et le cancer. (Roumeissa et Maya, 2015).

Les tanins sont des substances poly phénoliques de structures variées, ayant en commun la propriété de tanner la peau, c'est-à-dire de rendre imputrescible. Ces substances ont en effet la propriété de se combiner aux protéines, ce qui explique leur pouvoir tannant.

On distingue: les tanins hydrolysables et les tanins condensés. Les tanins sont largement répandus dans les organismes végétaux et plus particulièrement dans les fruits, les graines

de céréales et diverses boissons. Dans l'alimentation humaine, les sources les plus importantes de tannins sont le vin et le thé (Boubekri, 2014b).

Ce sont des oligomères ou des polymères de flavane-3-ol dérivés de la catéchine ou de son isomère. Ils ont la propriété de coaguler les protéines du derme, d'où leur utilisation dans le tannage des peaux (Nadir, 2016).

Les tanins condensés (Figure 14) sont des polyphénols de masse molaire élevée. Ils résultent de la polymérisation auto-oxydative ou enzymatique des unités de flavan-3,4-diol liées majoritairement par les liaisons C4-C8 (parfois C4-C6) des unités adjacentes, et se nomment ainsi pro anthocyanidines de type B. Lorsque la condensation se produit entre les unités adjacentes par la liaison C4-C8 et par une liaison d'éther additionnelle entre et C7, les pro anthocyanidines sont dits de types A (Boubekri, 2014a).

Les tanins hydrolysables (Figure 15) ou acides tanniques sont des polymères de l'acide gallique ou de son produit de condensation ; l'acide éllagique. Ils ont un poids moléculaire plus faible et précipitent beaucoup moins les protéines que les tanins condensés.

Ils peuvent diminuer la dégradation des parois dans le rumen et être hydrolysés dans l'intestin en libérant des produits toxiques pour le foie et le rein. Ils sont divisés en

éllagitannins et gallo tannins. Les gallo tannins libèrent de l'acide gallique par hydrolyse acide, hydrolyse basique, à l'eau chaude ou par action enzymatique (Boubekri, 2014a).

Les propriétés biologiques que possèdent un certain nombre de plantes présentent un intérêt énorme pour l'Homme dans le domaine agroalimentaire, pharmaceutique, médicale et même dans la recherche scientifique. Cependant des composés phénoliques ou des coagulants sont beaucoup utilisés dans le domaine alimentaire et médical.

Le but de notre travail pratique est de contribuer à la valorisation de deux plantes du genre Cynara (Cynara scolymus = artichaut cultivé) et (Cynara cardunculus = artichaut sauvage) sur l'évaluation de l'activité coagulante des extraits de fleurs dans le lait de vache en comparaison de celle de la présure. Aussi, le dosage des composés phénoliques dans les fleurs et bractées, et l'évaluation de leurs activités antioxydantes.

Pour rendre compte des résultats de notre travail, nous avons procédé comme suit :

Le présent travail a été réalisé au niveau du laboratoire de Technologie Alimentaire de l'Institut National de Recherche Agronomique de Rabat (INRA).

? Volet échantillonnage : inclue l'échantillonnage du matériel végétal du l'artichaut sauvage (Cynara cardunculus) et l'artichaut cultivé (Cynara scolymus), celui du lait frais de bovin et de la présure.

? Volet biochimique : inclue l'extraction des composés phénoliques à partir des bractées de l'artichaut cultivé et celui sauvage, dosage des polyphénols totaux, des

flavonoïdes, des tanins condensés et aussi de l'activité antioxydante par deux méthodes (DPPH, ABTS).

Ce volet inclue aussi l'extraction de l'extrait coagulant du lait à partir des fleurs de l'artichaut sauvage et de l'artichaut cultivé, et l'évaluation de l'activité coagulante et protéolytique de ces extraits dans le lait.

L'échantillonnage de la partie florale de ces deux plantes a été effectué sur les deux stades c'est-à-dire le premier stade où il n'y a pas l'ouverture de la fleur tandis que le second stade correspond à la présence d'une ouverture concrète de la fleur.

Pour le premier stade, les fleurs de l'artichaut cultivé (Figure 16) ont été récoltées dans la région de Sidi Slimane (ville du Nord-Ouest du Maroc, située environ à 60 km de la ville portuaire de Kénitra) au début du mois d'avril 2019, et au mois de juin avec l'apparition nette des fleurs (Figure 17) on a procédé à l'échantillonnage pour le second stade. Les fleurs de l'artichaut sauvage (Figure 18) ont été récoltées dans les montagnes d'Oulmès au début du mois d'avril pour le premier stade et le mois de juin pour le second stade (Figure 19).

Le matériel végétal utilisé est constitué de la partie florale (bractées et fleurs) de l'artichaut Cynara scolymus et Cynara cardunculus. Les fleurs et les bractées sont séchées par lyophilisation afin de conserver les molécules sensibles à la chaleur telle que les enzymes, les protéines. Cette technique de déshydratation conserve la qualité nutritionnelle et organoleptique des aliments et les propriétés biologiques des molécules. Après séchage, le broyage est effectué à l'aide d'un Moulinex à café (Figure 20) ou un broyeur électrique (Figure 21).

Figure 18. Fleur de l'artichaut sauvage sans ouverture (premier stade)

Figure 19. Fleur de l'artichaut sauvage
avec ouverture (second stade)

Le lait utilisé pour la détermination de l'activité coagulante est le lait de vache (Figure 22) et a été récolté dans la région de Zaër. La présure (Figure 23) est celle utilisée par la société Ajbane Chefchaouen spécialisée dans la fabrication du fromage. Elle est un

coagulant microbien issu du mucor pepsine, produit par fermentation en utilisant une souche sélectionnée du champignon Rhizomucor miehei.


Figure 22. Lait utilisé après ajustement du pH	Figure 23. Présure utilisée

II.2. Extraction des composés phénoliques II.2.1. Préparation des extraits

La méthode d'extraction suivie dans notre étude est l'extraction par macération effectué selon le protocole proposé par Romani et al., (2006) avec quelques modifications. Le principe de cette méthode se base sur la macération de matériel végétal dans un solvant d'extraction acétone 70% suivi d'une agitation ainsi que la centrifugation pendant 20 minutes. La partie de la plante utilisée est le capitule du chardon et d'artichaut : bractées.

Le protocole se résume comme suit (Romani et al., 2006) : 2g de poudre de fleur/bractée d'artichaut

Macération au bain marie 40°C avec agitation dans 20 ml d'acétone 70% pendant 3h

II.2.2. Dosage des composés phénoliques II.2.2.1. Dosage des polyphénols totaux

Le dosage des polyphénols totaux a été fait en utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu. Cette méthode a été décrite Singleton et Rossi (1965). Depuis, son utilisation s'est largement répandue pour caractériser les extraits végétaux d'origines plus diverses.

Le réactif de Folin-Ciocalteu est un acide de couleur jaune constitué par un mélange d'acide phosphotungstique _(H3PW12O40) et d'acide phosphomolybdique _{(H3PMo12O40).} Il est réduit lors de l'oxydation des phénols, en un mélange d'oxydes bleus de tungstène et de molybdène (Ribéreau-Gayon et Peynaud, 1968). La coloration produite, dont l'absorption maximum à 765nm est proportionnelle à la quantité de polyphénols présents dans les extraits végétaux (Boizot et Charpentier, 2006).

Les polyphénols (PP) ont été déterminés par spectrophotométrie, suivant le protocole appliqué par Li et al. (2007). 100 ìl d'extrait végétal dilué 20 fois est mélangé avec 500 ìl de réactif de Folin Ciocalteu (FCR) dilué 10 fois dans de l'eau distillée. Après 4 minutes d'incubation, 400 ìl de carbonate de sodium (Na2CO3) à concentration de 7,5% sont ajoutés. Après une incubation du mélange réactionnel pendant 1 heure 30 minute à température ambiante en l'obscurité, l'absorbance est mesurée à 765 nm.

La courbe d'étalonnage (Annexe 2) est effectuée par l'acide gallique à différentes concentrations (0 - 50 ìg/ml), dans les mêmes conditions et les mêmes étapes du dosage. Les résultats sont ainsi exprimés en mg/ml en se référant à la courbe d'étalonnage d'acide gallique.

Les flavonoïdes possèdent un groupement hydroxyle (OH) libre, en position 5 qui est susceptible de donner avec le groupement CO, un complexe coloré avec le chlorure d'aluminium.

Les flavonoïdes forment des complexes jaunâtres par chélation des métaux (fer et aluminium). Ceci traduit le fait que le métal (Al) perd deux électrons pour s'unir à deux atomes d'oxygène de la molécule phénolique agissant comme donneur d'électrons.

La détermination des flavonoïdes totaux a été effectuée selon la méthode décrite par Dehpour et al., (2009) ayant subi quelques modifications : 500 ìl de chaque extrait à analyser sont ajoutés à 1500 ìl de acétone 70 %, 100 ìl de AlCl3 à 10 % (m/v), 100 ìl d'acétate de sodium 1 M et 2,5 ml d'eau distillée.

Le mélange est agité puis incubé à l'obscurité et à température ambiante pendant 30 min. Le blanc est réalisé par remplacement de l'extrait par d'acétone 70% et l'absorbance est mesurée à 415 nm en utilisant un spectrophotomètre UV (Perkin Elmer). Les résultats sont exprimés en concentration mg/ml en se référant à la courbe d'étalonnage de la quercétine. (Annexe 3)

Les tanins condensés sont déterminés par la méthode de la vanilline en milieu acide décrite par (Taouzinet, 2017). Le réactif de vanilline a été préparé en mélangeant 4 g de vanilline dans 100 ml de l'éthanol.

Le mélange a été maintenu à 30 °C avant le dosage. 100 ìl de chaque extrait à analyser ont été ajoutés à 1500 ìl du réactif de vanilline 4 % et après on ajoute 750 ìl de HCl concentré à 37%. Le mélange a été agité puis incubé à l'obscurité à 30°C pendant 20 min. L'absorbance est mesurée à 550 nm par un spectrophotomètre UV (Perkin Elmer) contre un blanc constitué d'un mélange d'acétone 70% et de HCl (37%) à volume égal. Les résultats sont exprimés en concentration mg/ml en se référant à la courbe d'étalonnage du catéchol (Annexe 4).

L'activité antioxydante a été évaluée en testant l'activité scavenging du radical DPPH, et ABTS+.

Le test au 2,2-diphényl-2-picryl-hydrazyle (DPPH.), permet de mesurer le pouvoir réducteur des substances antioxydantes contenues dans un extrait.

Le DPPH est un radical libre de couleur violette qui devient jaune quand il est réduit par un donneur de proton H⁺.

Où AH est un composé capable de céder un H⁺ au radical DPPH (Ibra et al., 2017). ? Protocole

Le protocole expérimental utilisé est celui de Ibra et al., (2017) avec quelques modifications. La solution de DPPH est préparée par solubilisation de 4mg de DPPH dans 100 ml d'éthanol. 200 ìl de l'extrait mélangé avec 1800 ìl de la solution de DPPH. Le mélange est agité puis incubé à l'obscurité et à température ambiante pendant 30 min. Le blanc est réalisé par remplacement de l'extrait par d'acétone 70% et l'absorbance est mesurée à 517 nm en utilisant un spectrophotomètre UV (Perkin Elmer).

Le pouvoir anti-radicalaire de l'extrait est exprimé en pourcentage d'inhibition du radical

Ce test est basé sur le mécanisme d'oxydoréduction de l'ABTS (sel d'ammonium de l'acide 2,2-azino bis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)).Au cours de ce test, le sel d'ABTS perd un électron pour former un radical cation (ABTS. +) de couleur sombre (vert bleu) en solution. En présence de l'agent antioxydant, le radical ainsi formé est réduit pour donner le cation ABTS⁺, ce qui entraine la décoloration de la solution (Owen et Johns, 1999).

L'addition d'un antioxydant à une solution de ce radical cationique entraine la réduction de ce radical et une diminution de l'absorbance. Cette diminution dépend de l'activité antioxydant des composés testes, du temps et de la concentration (Re et al., 1999)

Le pourcentage d'inhibition du radical ABTS.⁺ est évalué par la méthode de (Nadir, 2016).

La solution d'ABTS. + est préparée par mélange de 7 mM d'ABTS et de 2,45 mM de persulfate de potassium incubé pendant 12-16h à l'abri de la lumière et à température ambiante avant l'utilisation. La solution d'ABTS est diluée avec l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une absorbance de 0,7(#177; 0,02) à 734 nm. 1,9 ml de la solution d'ABTS sont additionnés à 100 ìl de l'extrait.

Après l'incubation pendant 7 min à l'obscurité et à température ambiante, on mesure la réaction de réduction de la solution d'ABTS à 734 nm. La capacité antioxydante des extraits testée, est exprimée par rapport aux concentrations de standard Trolox (TEAC) ; ce qui donne des indications utiles sur le potentiel antioxydant de l'extrait de plantes.

Le pouvoir anti-radicalaire de l'extrait est exprimé en pourcentage d'inhibition du radical ABTS+ :

II.2.4. Extraction du système enzymatique des fleurs II.2.4.1. Obtention de l'extrait enzymatique des fleurs

Le système enzymatique utilisé a été obtenu à partir des fleurs lyophilisées (Figure 26). Elles ont subi une congélation pendant trois jours suivis d'une lyophilisation d'une semaine puis un broyage grâce à un broyeur électrique.

Le protocole utilisé dans ce travail est celui décrit par Tsouli (1974)et optimisé par (Nouani et al., 2009) subit quelques modifications : broyage et macération (Figure 27) pendant 24h à température ambiante et à l'obscurité de 10 g de fleurs sèches dans 100 ml du tampon d'acétate de sodium (0,1 M à pH 5) additionné de 0,2% d'acide borique afin d'éviter ultérieurement toute prolifération de microorganismes. Dans le but d'extraire le maximum de matière enzymatique le tout est congelé à -22°C pendant 48h puis décongelé à température ambiante sous une agitation douce pendant 1h, le liquide est ensuite centrifugé à 4200 g pendant 10 minutes, le surnageant est ensuite filtré et l'extrait brut des fleurs de l'artichaut est obtenu (Figure 28).

L'activité protéolytique est mise en évidence par un dosage colorimétrique des groupements tyrosine à l'aide du réactif de Folin-Ciocalteu ; conformément à la technique décrite par Aicha (2003) cité dans Zikiou et Zidoune (2019) avec quelques modifications. La comparaison de l'activité protéolytique a été faite entre l'extrait enzymatique des fleurs séchées et la présure d'origine microbienne avec un gradient de concentration de: 25%, 50%, 75% et 100%.

? La première étape étant la réaction enzymatique, dont le mélange est constitué de : 1 ml de l'extrait! présure, 1.5 ml de tampon citrate ! sodium 0.05 M, pH 5.5 et 2.5

L'incubation se fait au bain marie à 40°C, après 1 h on ajoute 5 ml de T.C.A à 4% pour arrêter la réaction et permet la précipitation de la caséine non hydrolysée. Les blancs réactionnels sont préparés de la même manière que l'échantillon sauf qu'ici le TCA est rajouté bien avant le substrat afin d'empêcher la réaction enzymatique. La centrifugation a été faite de 3000 rpm pendant 5 minutes enfin de récupérer le surnageant.

? La deuxième étape étant le dosage colorimétrique, après centrifugation les composés azotés non protéiques qui se trouvent dans la phase soluble, sont dosés selon la méthode d'Anson (1958) : 0.5 ml de surnageant avec 2.5 ml de Na2CO3 à 2% dans NaOH 0.1 N.

Après agitation et repos 10 min, on ajoute 0.25 ml de réactif de Folin-Ciocalteu dilue au 1/2. Bien agiter et incuber 30 minutes à température ambiante. L'absorbance est lue contre le blanc réactionnel à 750 nm au spectrophotomètre.

L'activité est calculée par référence à une courbe d'étalonnage établie en utilisant la tyrosine comme standard. La gamme étalon est réalisée à partir d'une solution de tyrosine dont les concentrations sont comprises entre 0 et 80 jig /ml. L'unité de l'activité protéolytique correspond à 1 jig de la tyrosine libéré par 1ml d'extrait enzymatique en une heure d'incubation. La concentration de la tyrosine contenue dans le filtrat est déduite par référence à une courbe d'étalonnage de la tyrosine (Annexe 1).

L'activité protéolytique de l'extrait des fleurs est comparée à celle de la présure, prise comme témoin.

L'activité coagulante est déterminée selon la méthode de Berridge (1952) et tel que modifié par Collins et al. (1977), Nouani et al. (2009) et Soumeya (2017). Cette méthode permet d'exprimer l'activité de l'extrait enzymatique en force coagulante. Il représente le volume

du lait coagulé par unité de volume de l'extrait enzymatique en 40 min, à 35 ° C et à pH 6,4 en fonction de la formule. Une unité Soxhlet (US) est définie comme la quantité d'enzyme qui coagule 1 ml d'une solution de substrat de Berridge à 30°C pendant 40minutes.

L'analyse des données a été effectuée par le logiciel Graphpad Prism 7.0 et les analyses statistiques ANOVA ont été réalisées à l'aide du logiciel SPSS version 23 . L'analyse de la variance a été appliquée pour déterminer la différence significative à p<0,05 entre plantes et stades.

III.1.Teneur en eau du matériel végétal

La teneur en eau est le rapport entre le poids sec et le poids total du matériel végétal

Après lyophilisation de l'échantillon végétal, la perte d'eau de la fleur de deux plantes a été considérable. De ce fait pour le premier stade nous remarquons que la teneur en eau est supérieure à celle du second stade quand la partie florale est mature. La teneur en eau de la partie florale utilisée pour toutes ces deux plantes est de 80% pour le premier stade tandis qu'elle est de 63% pour le second stade.

D'après les analyses statistiques effectuées par SPSS montrent une différence très significative (p<0,007) entre le second stade plante cultivée et le premier stade plante sauvage. Une différence significative (p<0,05) se manifeste entre le second stade plante sauvage et second stade plante cultivée. La comparaison des autres stades surtout entre le premier stade plante cultivée ne montre pas des différences entre eux. Les résultats des concentrations en polyphénols totaux sont présentés dans la figure 29.

D'après cette figure 29 on constate que les concentrations des polyphénols totaux de la plante sauvage sont supérieures à ceux de la plante cultivée sur les deux stades. Les moyennes avec leur valeur standard sont exprimées dans le tableau 8.

1er stade		Moyenne (mg/ml)
	PPTs	1.08#177;0.15

	PPTc	0.62#177; 0.08
2ème stade	PPTs	0.82#177;0.10
	PPTc	0.37#177;0.10

PPTs : Polyphénols totaux pour extrait de la plante sauvage ; PPTc : Polyphénols totaux pour extrait de la plante cultivée

Etude du pouvoir coagulant et antioxydant de l’artichaut sauvage et de l’artichaut cultivé au maroc

CHAPITRE III. Les métabolites secondaires

III.1.Teneur en eau du matériel végétal