1. Dosage du glucose : Ref : 1001191
Le Principe : Le glucose oxydase (GOD)
catalyse l'oxydation de glucose à l'acide gluconique le peroxyde
d'hydrogène (H2O2) produit est détecté au moyen
récepteur cromogénique d'oxygène, en présence de
POD.
Glucose oxydase
Glucose + O2 acide gluconique+H2O2
2 H2O2 + phénol +4AAP Quinonéimine +
4H2O
4AAP : amino-4antipique.
Les réactifs utilisés sont :
-réactif.1 :
TRIS pH 7.4.......... 92mmol/L.
Phenol..................0.3mmol/L.
-réactif.2 :
glucose oxydase (GOD)........... 15000 U/L
Peroxydase (POD) ..........1000U/L.
4- Aminophenazone (4- AP) .............2.6 mmol/L
-réactif.3 (standard) :
Glucose ..........100mg/Dl.
Echantillons : Sérum.
- Le mode opératoire :
Dans une série de tubes à
prélèvement (X n+2 d'où n= le nombre des
échantillons et 2 et 1 sont : un pour le blanc et le
2ème pour l'étalon) voir (fig.30).
Mettre dans chaque tube 1ml de solution de travail (qui est le résultat
du mélange de R1 et R2). On ajoute 10 ul de la solution d'étalon
dans le tube d'étalon et 10ul du sérum dans les tubes des
échantillons déjà codé. On mélange bien et
on laisse incuber 5min dans l'étuve à 37°C. Puis on lit la
longueur d'onde de chaque tube avec le spectrophotomètre en respectant
:
-longueur d'onde : 505 nm.
-cuve : 1 cm de diamètre.
La calibration du spectrophotomètre se fait par la
solution du blanc
Pour les calculs:
DO dosage x n
DO etalon
Ou n : est la concentration de l'étalon =1g/L
Les valeurs sont dites normales si les résultats
font partie de l'intervale suivant : 0.7-1.05g/l ou 3.89-5.84mmol/l
10ul de R3
Blanc Standard
L'incubation à 37°C pendant 5mn
1ml de R3
Echantillon
1 ml de RT
1 ml de RT
1 ml de RT
10ul de sérum
Blanc Standard Echantillon
Fig. 30 : La technique du dosage de Glucose
2- Dosage de cholestérol total :Ref :1001092
Le principe ; la détermination
enzymatique du cholestérol suivant ces réactions :
Cholestérol estérifié + H2O cholestérol + acide
gras.
cholestérol estérase
Cholesterol + O2 Cholesterol -4-one-3-H2O2.
Cholesterol oxydase
Peroxidase
2H2O2+ phénol + 4AAP quinonéimine+4 H2O.
L'intensité de la couleur formée est
proportionnelle à la concentration du cholestérol dans
l'échantillon.
Les réactifs utiliser :
Réactif.1 (solution tampon) :
PIPES pH 6.9..... 90 mmol/L
Phenol .....26mmol/L
Réactif.2 RIenz\ Pe) :
Cholestérol estérase (CHE) ~~~.. 300U/L
Cholestérol oxydase (CHOD) ...300U/L
Peroxydase (POD) ~~~~~~~1250U/L
4- Aminophenazone (4-AP) ~~~~0.4mmol/L
Réactif.3 : (standard)
Cholestérol 200mg/dL
Echantillon : sérum.
Mode opératoire :
Dans une série de tubes à
prélèvement (X n+2 d'où n= le nombre des
échantillons et 2 et 1 sont : un pour le blanc et le
2ème pour l'étalon) voir (fig.31).
Mettre dans chaque tube 1ml de solution de travail (qui est le résultat
du mélange de R1 et R2). On ajoute 10 ul de la solution d'étalon
dans le tube d'étalon et 10ul du sérum dans les tubes des
échantillons déjà codés. On mélange bien et
on laisse incuber 5min dans l'étuve à 37°C. Puis on lit la
longueur d'onde de chaque tube avec le spectrophotomètre en respectant
:
- longueur d'onde : 505 nm.
- cuve : 1 cm de diamètre.
La calibration du spectrophotomètre se fait par de l'eau
distillée.
1 ml de RT
Le calcul :
DO dosage x n
DO étalon
n : la concentration de l'étalon = 200 mg/dL
Les valeurs sont dites normales si les résultats
sont dans l'intervalle suivant :
150 - 260 mg/dL
10ul de R3
1 ml de RT
1 ml de RT
10ul de sérum
Blanc Standard Echantillon
L'incubation à 37°C pendant 5mn 1ml de R3
Blanc Standard Echantillon
Fig. 31 : La technique du dosage de
Cholestérol
3. Dosage d'albumine :Ref :1001020
Le principe :
L'albumine en présence de bromocrésol vert
à un pH légèrement acide, produit un changement de couleur
de l'indicateur du jaune vert au vert-blue. L'intensité de la couleur
formée est proportionnelle à la concentration de l'albumine dans
l'échantillon.
Les réactifs utilisés :
-Réactif.1 : vert de bromdresol pH4.2
...........0.12mmol/L
- réactif.2 : (étalon) : albumine
..............5g/dL
Echantillon : sérum.
3.2 Mode opératoire :
Dans une série de tubes à
prélèvement (X n+2 d'où n= le nombre des
échantillons et 2 et 1 sont : un pour le blanc et le
2ème pour l'étalon) voir (fig.32).
Mettre dans chaque tube 1ml de solution de travail (qui est le
réactif R1). On ajoute 5 ul de la solution d'étalon dans le tube
d'étalon et 5ul du sérum dans les tubes des échantillons
déjà codés chaque tube avec un malade. On mélange
bien et on laisse incuber 5min dans l'étuve à 37°C. Puis on
lit la longueur d'onde de chaque tube avec le spectrophotomètre en
respectant :
-longueur d'onde : 630 nm.
-cuve : 1 cm de diamètre.
La calibration du spectrophotomètre se fait par la
solution du blanc.
Calcul : DO dosage x
n
DO étalon
n ;a concentration de l'étalon= 5 g/dL
Les valeurs sont dites normales si elle en fait partie de
l'intervalle suivant : 3.5-5 g/dl
Blanc Standard
Echantillon
5ul de R2
L'incubation à 37°C pendant 5mn
1 ml de R1
1 ml de R1
1 ml de R1
5ul de sérum
Blanc Standard Echantillon
Fig. 32 : La technique du dosage d'albumine
Dosage de l'urée :Ref :1001331.
Le principe :
L'urée dans l'échantillon est hydrolysée
enzymatique ment en l'ammoniac NH4 et le dioxyde de carbone CO2. Les ions
d'ammoniaque formés réagissent avec le salicylate et
l'hypochlorite de sodium (NaCIO) en présence du catalyseur
nitroprusside, forme un vert indophénol :
Urea + H2O NH4 + CO2
Urease
NH4 + salycilate + NaCIO indophenol.
Nitroprusside
L'intensité de la couleur formée est
proportionnelle à la concentration d'urée dans
l'échantillon.
Réactifs utilisés :
-Réactif.1 :
Phosphate pH6.7 : ~~~~~~..50mmol/L.
EDTA ~~~~~..~~~~~~.2mmol /L.
Salicylate de sodium : ~~~~~.. 400mmol/L. Nitroprusiate de sodium
: ~~~~..10mmo/L.
- réactif.2 :
Hypochlorite de sodium (NaCIO) 140mmol/L.
Hydroxyde de sodium ~~~~~~.150mmol/L
-Réactif.3 'enzyme) : 1
enzyme)
Uréase : ~~~~~~~~~~. 30000 U/L.
- - Réactif.4
:(étalon)
EI
Urée~~~~~~~~~. 50 mg/dL
Echantillon : sérum.
Mode opératoire : Dans une
série de tubes à prélèvement (X n+2
d'où n = le nombre des échantillons et 2 et 1sont : un pour le
blanc et le 2ème pour l'étalon) voir
(fig.33). Mettre dans chaque tube 1ml de solution de travail
(qui est le résultat du mélange de R1 et R3). On ajoute 10 ul de
la solution d'étalon dans le tube d'étalon et 10ul du
sérum dans les tubes des échantillons déjà
codés chaque tube avec un malade. On mélange bien et on laisse
incuber 5min dans l'étuve à 37°C. Puis on ajoute 1ml du
réactif R2, on mélange bien et on réincube 5min dans la
température ambiante. On lit l'absorbance « A » de chaque tube
en respectant : -longueur d'onde : 580 nm.
-cuve : 1 cm de diamètre.
La calibration du spectrophotomètre se fait par la
solution du blanc.
Calcul : DO dosage x n
DO étalon
n : la concentration de l'étalon = 50 mg/dL Les
Valeurs normales de l'urémie doivent êtres dans l'intervalle
suivant :
15-45 mg/dL, 2.49-7.49 mmol
/L
10ul de R4
1 ml de RT
1 ml de RT
1 ml de RT
10ul de sérum
Blanc Standard Echantillon
La 1ère incubation à 37°C
pendant
5
1ml de R2 1ml de R2
1ml de R2
Blanc Standard Echantillon
La 2ème incubation à 37°C
pendant
5
Blanc Standard Echantillon
Fig. 33 : La technique du dosage de l'urée
79
5. dosage de protéines totales: Ref
:1001291
Le principe :
Les protéines donnent un complexe bleu violet intensif
avec des sels de cuivre dans un milieu alcalin. L'iodide est inclus comme un
antioxydant.
L'intensité de la couleur formée est
proportionnelle à la concentration de protéine totale dans
l'échantillon.
Réactif utilisé :
-Réactif.1 :
Sodium potassium tartrate ...........15mmol/L
Sodium iodide ....................100mmol/L
Potassium iodide ................5mmol/L
Copper (II) sulphate .................19mmol/L
-Réactif.2 (standard) : albumine bovine
.........7 g/dL.
Echantillon : sérum, le sang doit
être prélevé sur tube sans anticoagulant.
Mode opératoire :
Dans une série de tubes à
prélèvement (X n+2 d'où n= le nombre des
échantillons et 2 et 1 sont : un pour le blanc et le
2ème pour l'étalon) voir (fig.34).
Mettre dans chaque tube 1ml de solution de travail (qui est le
réactif R1). On ajoute 25ul de la solution d'étalon dans le tube
d'étalon et 25ul du sérum dans les tubes des échantillons
déjà codés chaque tube avec un malade. On mélange
bien et on laisse incuber 5min dans l'étuve à 37°C. Puis on
lit l'absorbance de chaque tube avec le spectrophotomètre en respectant
:
-longueur d'onde : 540 nm.
-cuve : 1 cm de diamètre.
La calibration du spectrophotomètre se fait par l'eau
distillée.
5.4. Calcul: DO dosage x n
DO étalon
n : la concentration de l'étalon = 7g/dL
Le taux normal de protides totaux doit êtres entre
:
6.6-8.3 g/dl
Blanc Standard
Echantillon
25ul de R2
L'incubation à 37°C pendant 5mn
1 ml de R1
1 ml de R1
1 ml de R1
25ul de sérum
Blanc Standard Echantillon
Fig. 34 : La technique de dosage de protéines
totales.
Il y a deux modalités de prélèvement
différent selon le tube :
a) Sans anticoagulant ("tube sec"): il y a
coagulation sanguine rapide, physiologique par une cascade enzymatique qui
aboutit à la transformation du fibrinogène en fibrine
(insoluble).
Fibrinogène monomère de fibrine
réseau de fibrine.
thrombine (IIa) XIIIa
Dans la fibrine se trouvent emprisonnés les
éléments cellulaires, le caillot sanguin est entouré du
sérum sanguin. On centrifuge pour récupérer le
sérum, sur lequel on effectue le dosage biochimique.
b) Avec anticoagulant (additif opposé
à la coagulation): après centrifugation, la phase liquidienne
ressemble au sérum mais est différente : il s'agit du plasma. Il
comporte encore le fibrinogène soluble alors que l'on a obtenu le
sérum après transformation en fibrine. Rq: L'anticoagulant peut
être:
-l'héparine de lithium.
-l'héparine de sodium.
-l'oxalate, le citrate, l'EDTA (éthylène diamine
tétra acétate) qui complexent le calcium et empêchent la
coagulation.
Le sang se compose essentiellement de trois sortes de
protéines déterminées globalement sous le nom de protides
totaux :
Protide totaux les albumines 60%
Les globines30%
La fibrinogène 10 _15%.
En éliminant la fibrinogène dans le sérum
obtenu, il a fallu prélever le sang dans un tube sec. Le
fibrinogène se transforme en fibrine et donne avec les restes des
éléments sanguins le caillot de la coagulation, donc dans le
sérum ne reste que l'albumine et les globines.
La valeur trouvée lors du dosage des protides totaux dans
ce sérum correspond à celle de l'albumine + globine.
Protide totaux = albumine + globine =» le taux de globine =
taux de protides totaux - taux d'albumine (mesuré
précédemment).
L'obtention de la valeur d'albumine et des globines nous permet
de calculer le rapport albumine / globine.
6. Dosage de TGP :Ref :1001171.
Principe :
L'alanine aminotransferase (ALT) ou Glutamate pyruvate
transaminase (TGP) catalyse le transfert réversible d'un groupement
aminé de l'alanine au alpha- cetoglutarate formant le glutamate et le
pyruvate.
Le pyruvate produit est réduit en lactate par la lactate
déhydrogénase (LDH) et NADH. Alanine + alpha- cetoglutarate
Glutamate + Pyruvate
ALT
Piruvate + NADH + H+ Lactate + NAD +
LDH
Réactif utilisé :
-Réactif.1 (tampon) :
TRIS pH7.8 ...........100mmol/L Alanine
................500mmol/L
-Réactif.2 :
|
NADH .................. 0.18mmol/L
Lactate déhydrogénase (LDH)........1200U/L
Alpha-Cétoglutarate ..................15 mmol/L.
|
Echantillon : sérum.
Mode opératoire :
Dans un tube à prélèvement on met 1ml de
solution de travail (qui est le résultat de la dissolution total de R2
dans 15ml de R1). On ajoute 100 ul de sérum (fig.35) et
on mélange bien puis on incube pendant 1 min. On lit l'absorbance
initial, puis les autre absorbance à 1min d'intervalle pendant 3
minutes, en respectant :
-longueur d'onde : 340 nm.
-cuve : 1 cm de diamètre.
La calibration du spectrophotomètre se fait par l'eau
distillée.
On calcule la différence entre les absorbances
trouvées, puis la moyenne par min (A/min). Calcule : A/min x
1750 = U/L de TGP.
Les valeurs normales de transaminase ALAT doivent
êtres inférieures à 40 U/L.
100ul sérum
1 ml de RT
Echantillon
Fig. 35 : La technique du dosage de TGP
6. Dosage de l'hémoglobine :
Le principe : Le sang est dilué dans
une solution d'acide chlorhydrique (HCL) à 0,1 N. Cette solution d'acide
transforme l'hémoglobine en hémoglobine acide qui a une couleur
brunâtre. On dilue le sang jusqu'à ce que sa couleur soit
comparable à celle du tube témoin de
l'hémoglobinométre (méthode de SAHLI).
Réactif utilisé :
Solution d'acide chlorhydrique à 0.1 N.
L'eau distillée.
Echantillon : sang total
Mode opératoire :
Dans un tube sec on met 500ul d'acide chlorhydrique puis on
ajoute 20ul de sang total on mélange très bien. A l'aide d'une
micropipette on remplie le tube de l'hémoglobinométre de la
solution. On dilue cette dernière avec l'eau distillé
jusqu'à ce que sa couleur soit comparable à celle du tube
témoin de l'hémoglobinométre voir
(fig.36).
Les valeurs normales :
Homme : 13-18g/dl, Femme : 12-16g/dl.
20ul Sang total
500 ul de HCL
Echantillon
Fig. 36 : La technique du dosage de
l'Hémoglobine
| 
