Memoire Online - Caractérisation de la population des dromadaires (camelus dromedarius) en Tunisie

Le dromadaire est souvent difficile à maîtriser, en particulier les mâles. Il peut être nécessaire, notamment pour les prélèvements du sang, d'assurer une contention sévère de l'animal (Photo 16). La position naturelle de repos du dromadaire est celle dite du baraqué, l'animal étant placé en décubitus sternal, les membres repliés sous lui. Le sang a été prélevé sur des animaux adultes dans les parcours et particulièrement dans les stations touristiques pour les mâles dans la région de Kebili. Le prélèvement du sang s'est fait sur l'animal baraqué cou tendu tiré vers l'avant pour faciliter une stase veineuse et éviter tout risque. Faye (1997) a

signalé que sur l'animal baraqué, la prise du sang est rendue plus aisée sur le cou replié contre le corps de l'animal. La zone de prélèvement sur la veine jugulaire est facilement repérable surtout après une pression même légère exercée à la base du cou ou à mi-distance entre le thorax et la tête. Le point de prélèvement le plus aisé est situé près de la tête.

L'emploi des tubes stériles sous vide avec bouchons en caoutchouc transperçable permet l'utilisation des aiguilles stériles plus fines et moins traumatisantes pour l'animal. Le sang est collecté dans des tubes contenant l'acide éthylène-diamine-tétra-acétique (EDTA) produit permettant la conservation des acides nucléiques du sang pour une longue durée. Pour la collecte proprement dite, l'aiguille est insérée dans la veine jugulaire de l'animal, une fois l'aiguille est en place l'écoulement du sang commence. L'aiguille est introduite dans le tube pour le rempli du sang (photo 16).

3- Extraction et évaluation de la qualité et la quantité de l'ADN génomique

Le matériel biologique de base pour ce travail est constitué du sang collecté dans des tubes EDTA puis congelé à -20°C. Les leucocytes (globules blancs) sanguins représentent la source majeure des acides nucléiques dans le sang. L'extraction de l'ADN génomique a été faite à partir de ce sang entier et congelé. Après une décongélation on fait éclater les globules rouges du sang par choc osmotique en les mélangeant à une solution hypotonique ou solution de lyse de globule rouge (SLR). La récupération des globules blancs est faite par centrifugation (photo 17). Un mélange de détergent de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) est ajouté pour détruire les membranes et de protéinase K pour digérer les protéines associées à l'ADN. La purification de l'ADN de protéines s'est faite par le chloroforme en ajoutant le sel (NaCl) pour augmenter la force ionique puis on précipite l'ADN par l'alcool absolu au froid. L'ADN se précipite sous forme de filaments (méduse), visibles à l'oeil nu, qui sont récupérés dans un tube eppendorf par une conne fixée sur une micropipette. La dissociation de

l'ADN s'est faite dans une solution tamponnée et conservatrice (TE) puis on le stocke à +4°C (voir le protocole détaillé d'extraction d'ADN annexe1).

L'estimation de la quantité et la qualité d'ADN étaient indispensables après son extraction. Elle s'est effectuée par spectrophotométrie (photo 18) à une longueur d'onde de 260 nm. Il était aussi également, indispensable de mesurer l'absorption à 280 nm, afin de pouvoir calculer le rapport (R) = DO260/DO280. Ce rapport renseigne sur la pureté de l'ADN et sa contamination éventuelle par des protéines. Un rapport compris entre 1,8 et 2 indique que l'ADN est propre.

L'absorption se définit par l'unité de densité optique (DO) mesurée à 260 nm. Une unité de densité optique correspond à l'absorption d'une solution d'ADN double brin à la concentration de 50 ug/ml ou à l'absorption d'une solution d'ADN ou d'ARN simple brin à la concentration de 25 ug/ml. Par la suite la concentration de l'ADN est calculée de la manière suivante :

Facteur de dilution = Vf /Vi, Vf = 1990ul H2O + 10 ul ADN = 2000 ul, Vi = 10ul ADN

Après avoir calculé la concentration de l'ADN mère, et dans le but de les utiliser ultérieurement, nous avons fait des dilutions selon la formule (1) :

Donc la dilution s'est faite comme : X ul ADN + (300-X) ul H2O, pour chaque échantillon.

Durant ces dernières années, les progrès en biologie moléculaire notamment les études concernant le matériel génétique grâce au développement de la technique de polymérisation en chaîne (PCR) ont grandement contribué au développement de la génétique moléculaire dont les informations s'intègrent de plus en plus aujourd'hui dans les schémas de sélection.

Cette technique permet d'amplifier des séquences d'ADN et d'augmenter considérablement la quantité d'ADN dont on dispose initialement. Elle nécessite de connaître la séquence des régions qui délimitent l'ADN à amplifier. L'amplification est réalisée dans des tubes PCR de 0,2 ml en utilisant un thermocycleur Biorad (photo 19).

Les conditions d'amplification sont les suivantes : une première dénaturation à 95°C pendant 10 minutes suivie de 35 cycles successifs, chaque cycle comprend une succession de trois phases : une dénaturation à 94°C (45 secondes), une phase d'hybridation à la température optimale déterminée entre 50-65°C (1 minute) selon l'amorce et une élongation à 72°C (1 minute). Enfin, une dernière étape d'élongation à 72°C (15 minutes) est programmée et une phase de refroidissement à 4°C. Ces conditions des cycles sont celles utilisées par Mburu et al. (2003). Ainsi, l'optimisation a été faite en fonction d'autres paramètres à savoir la concentration et le volume. Le volume réactionnel utilisé pour chaque échantillon est de 25 ul avec les concentrations et les volumes des réactifs résumés dans le tableau (8).

Réactifs	Concentration initiale	Concentration finale	Volume à prélever (ul)
Tampon	5X	1X	5
MgCl2	25 mM	2,5 mM	2,5
dNTP	2 mM	0,2 mM	2,5
Amorce droite	20 uM	0,5uM	0,625
Amorce gauche	20 uM	0,5uM	0,625
Taq	5U/ul	1U	0,2
ADN	10 ng/ul	50 ng/ul	8
Total			19,45
H2O bidistillée			5,55
Total			25

Photo 17 : Centrifugeuse Photo 18 : Spectromètre Photo 19 : Thérmocycleur

Dans le cadre de ce travail, 8 marqueurs microsatellites ont été considérés pour caractériser la variabilité génétique des dromadaires en Tunisie. Ces marqueurs ont été choisis tout en considérant des microsatellites retenus dans d'autres projets de recherche ainsi que certains recommandés par la FAO (2004) pour analyser la diversité génétique des camélidés. La liste de ces marqueurs est reportée dans le tableau (9). Au total 8 paires d'amorces ont été utilisées : CVRL01, CVRL02, CVRL05, CVRL06 et CVRL07 (Mariasegaram et al., 2002; Sasse et al., 2000), VOLP03 et VOLP32 (Obreque et al., 1998) et YWLL02 (Lang et al., 1996). Ils ont étudiés par PCR puis électrophorèse en gel dénaturant de polyacrylamide (PAGE) à 6% qui permet de distinguer les allèles en fonction de leur taille en utilisant un séquenceur du type (Bio Rad: Sequi-Gen@ GT).

Amorces	Séquences	Locus	Ta
A 1 A 2	5' GAA GAG GTT GGG GCA CTA C 3' 5' CAG GCA GAT ATC CAT TGA A 3'	CVRL01	57
A 3 A 4	5' TGT CAC AAA TGG CAA GAT 3' 5' AGT GTA CGT AGC AGC ATT ATT T 3'	CVRL02	60
A 5 A 6	5' CCT TGG ACC TCC TTG CTC TG 3' 5' GCC ACT GGT CCC TGT CAT T 3'	CVRL05	60
A 7 A 8	5' TTT TAA AAA TTC TGA CCA GGA GTC TG 3' 5' CAT AAT AGC CAA AAC ATG GAA ACA AC 3'	CVRL06	60
A 9 A 10	5' AAT ACC CTA GTT GAA GCT CTG TCC T 3' 5' GAG TGC CTT TAT AAA TAT GGG TCT G 3'	CVRL07	58
A 11 A 12	5' AGA CGG TTG GGA AGG TGG TA 3' 5' CGA CAG CAA GGC ACA GGA 3'	VOLP03	64
A 17 A 18	5' GTG ATC GGA ATG GCT TGA AA 3' 5' CAG CGA GCA CCT GAA AGA A 3'	VOLP32	66
A 19 A 20	5' GTG CAC TCA GAT ACC TTC ACA 3' 5' TAC ATC TGC AAT GAT CGA CCC 3'	YWLL02	62

La résolution en gel d'agarose est satisfaisante pour mettre en évidence l'ADN génomique, mais ne permettra cependant pas d'avoir une sensibilité suffisante nécessaire pour étudier le polymorphisme de l'ADN microsatellite. Les différences attendues entre les fragments de loci amplifiés chez les différents individus sont en effet minimes (quelques paires de bases), il sera donc nécessaire d'augmenter la sensibilité de discrimination. Pour cela, l'utilisation d'un gel de polyacrylamide augmentera la résolution et la sensibilité de la lecture ce qui peut mettre en évidence de très légères variations de poids moléculaire, les fragments les plus lourds migrants moins vite. Tous les individus sont alors criblés, par microsatellite. En effet, l'étude de cette variabilité des poids moléculaires de ces marqueurs renseigne sur la dynamique de la population: fréquence des allèles, répartition plus ou moins homogène des variations observées au sein des populations présentes dans les différentes régions, diversité génétique. En effet, la migration sur gel de polyacrylamide est une matrice de séparation utilisée en électrophorèse verticale des fragments d'ADN. Morgante et Olivieri (1993) ont signalé que cette technique permet de séparer des fragments d'ADN même avec une seule base nucléotidique de différence tel le cas des marqueurs microsatellites. La solution de polyacrilamide à 6% de volume de 120 ml a été préparée à partir d'une solution à 40% d'acrylamide qui est l'unité de base et de bisacrylamide (19 :1), urée et le TBE. Ces trois solutions sont mélangés et chauffés jusqu'à la dissolution complète de l'urée. La réaction de polymérisation proprement dite, se fait grâce à l'ajout de deux substances réactives : le TEMED et le persulfate d'ammonium. Le tableau (10) résume la composition du gel :

Le volume réactionnel final est ramené à 120 ml par l'ajout de l'eau distillée. La polyacrylamide est un gel finement réticulé, que l'on fabrique au moment de l'emploi en mélangeant de l'acrylamide (CH2=CH-CO-NH2), qui polymérise en donnant des chaînes linéaires, et du bis-acrylamide (CH2=CH-CO-NH-CO-CH=CH2) qui forme des ponts entre

les chaînes, on obtient ainsi un réseau, dont les mailles sont de taille variable en fonction des proportions d'acrylamide et de bis-acrylamide utilisées, le gel obtenu se comporte donc comme un tamis moléculaire (les macromolécules migrent d'autant moins vite qu'elles sont plus grosses). La migration s'est faite comme dans le dispositif (Photo 20) pendant 2 heures sous 75 wats. La coloration se fait selon les étapes résumées dans le tableau 11 (Benbouza et al., 2006).

Tableau 11 : Etapes de la méthode de coloration au nitrate d'argent utilisée (Annexe 2)

La diversité génétique au sein de la population des dromadaires (Kebili, Médenine et Tataouine) a été analysée entre et au sein de ces populations. Ces deux niveaux d'analyse complémentaires ont mobilisé des outils différents. Généralement, l'analyse de données issues d'étude de polymorphisme de marqueurs de types microsatellites nécessite une approche

statistique particulière. Avant de décrire les paramètres de variabilité, il nous parait utile de rappeler le principe de l'Equilibre de Hardy Weinberg utilisé comme référence afin de bien comprendre les forces agissant sur les structures génétiques des populations.

L'équilibre de Hardy Weinberg demeure le modèle central en génétique des populations. Sa mise en évidence remonte au début du XXème siècle par un mathématicien anglais G.H.Hardy et un médecin allemand et W. Weinberg. Ce modèle stipule que : les fréquences allèliques restent stables de génération en génération dans une population diploïde idéale et ne dépendent que des fréquences de la génération initiale. La notion d'équilibre dans ce modèle repose sur les hypothèses suivantes: i) la population est panmictique (croisement au hasard, fertilité des gamètes et viabilité des zygotes sont égales), ii) la population est de grande taille, iii) il ne doit y avoir ni sélection, ni mutation, ni migration, et iv) les générations ne sont pas chevauchantes (c'est-à-dire qu'il n'y a pas de croisement entre individus appartenant à différentes générations). En matière de conservation, l'équilibre de Hardy Weinberg présente des implications importantes. En effet, il est possible de prédire, dans une population en équilibre de Hardy Weinberg, les fréquences des différents génotypes à partir des seules fréquences allèliques. De plus, la ségrégation mendélienne aléatoire des chromosomes préserve la variabilité génétique des populations. Puisque les fréquences allèliques demeurent stables au cours du temps, une population diploïde idéale n'évolue pas. Seules les violations des hypothèses déjà mentionnées permettent un changement des fréquences allèliques au sein de la population. Une perturbation de l'équilibre de Hardy Weinberg donne des indications sur la divergence génétique des populations. Celle-ci dépend de quatre facteurs évolutifs i) la sélection, ii) les mutations aléatoires, iii) la dérive génétique, et iv) le flux génique (migration). Les trois premiers facteurs, considérées comme des forces évolutives peuvent provoquer, soit individuellement soit en combinaison, la différenciation des populations. Par contre, le flux génique entre populations tend à contrebalancer les processus de diversification et à causer une certaine ressemblance génétique dans les populations. La conséquence de l'action des facteurs évolutifs est de faire varier le taux d'hétérozygotes de la population par rapport à l'équilibre de Hardy Weinberg. Donc il est logique de quantifier ces écarts entre le taux d'hétérozygotes observés et le taux à l'équilibre.

Dans ce travail, on a utilisé la statistique ÷ 2 pour tester si une population est en équilibre de Hardy Weinberg. Cette statistique est basée sur la disparité des effectifs de

génotypes observés aux effectifs de génotypes théoriques. Le calcul a été effectué à l'aide du logiciel PopGene version 1.31 (Yeh, 1999).

Le calcul des paramètres permettant de quantifier la variabilité génétique intra et inter populations a impliqué plusieurs logiciels.

Caractérisation de la population des dromadaires (camelus dromedarius) en Tunisie

II- MATERIEL ET METHODES