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Diagnostic moleculaire du complexe mycobacterium tuberculosis chez les patients a risque de tuberculose resistante a la rifampicine et/ou a l'isoniazide au Burkina-Fasopar Gildas le Djimbaye Togde Université Catholique de l'Afrique de l'Ouest - Master 2015 |
ABSTRACTTuberculosis is a curable disease but it still kills millions of people around the world each year and the resistance forms of this disease increase highly nowadays in developed countries. HIV epidemic increases tuberculosis' rate. This present study is to evaluate the proportion of resistant tuberculosis to the rifampicin or isoniazid according to the sociodemographic and clinical's characteristics among patients whom samples have been analyzed in the National Reference's Laboratory of Mycobacteria in Ouagadougou. From the end of 2012 to the beginning of 2013; 204 patients have been registered into the National Reference's Laboratory of Mycobacteria to research tuberculosis' resistance against rifampicin and/or isoniazid. Our study started from October 2013 to October 2014 to evaluate the proportion of mycobacterium complex to the patients with resistance against rifampicin and multidrugresistance risk. The microscopy has been realized after the coloration with auramine according to the fluorescence method. The molecular tests have been realized after decontamination of samples according to the Petroff's method for the GenoType MTBDR plus essay ver.2 test and after neutralization for Xpert TB/Rif. We got 204 samples which have been analyzed for the Mycobacterium Tuberculosis Complex diagnosis. The results gave 34 (16.67%) strains of non-tuberculous mycobacterium and 170 (83.33%) of MTBC; 166 (81.37%) of samples provided from male patients and 38 (16.63%) from female patients. 99 (48.53%) patients have been submitted to HIV test. The rate of tuberculosis resistant to rifampicin was about 34% and the multidrugresistance about 32%. Nevertheless there was no significant link between HIV and the resistance. Conclusion: In Burkina-Faso, the resistant and multi-resistant forms of tuberculosis constitute a great public health problem which should be taken care. With resistance against rifampicin rate over WHO level, the Program of Fight against Tuberculosis has many challenges to accept in fighting against resistant and multidrugresistant forms of tuberculosis. Keywords: Resistant, multidrugresistant, tuberculosis, Burkina-Faso Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 1 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE INTRODUCTIONLes mycobactéries appartiennent au genre Mycobacterium seul genre bactérien appartenant à la famille des Mycobacteriaceae et à l'ordre des Actinomycétales avec des propriétés tinctoriales particulières. Après une coloration en rouge par la fuchsine, les mycobactéries ne sont pas décolorées par l'action combinée d'acide-alcool d'où leur appellation de Bacille Acido-Alcoolo-Résistant (BAAR). Cette propriété est due à la présence d'une paroi riche en lipides spécifiques, et en acides mycoliques faisant de la paroi la plus épaisse des parois bactériennes d'environ 9-10 nm d'épaisseur (Elena S Kostryukova, 2014). Le matériel génétique (ADN) des mycobactéries contient 61 à 71% de guanine-cytosine (DIANDE Souba, 2010). Dans le genre mycobacterium, on compte près de 138 espèces dont l'espèce majoritaire est le M. tuberculosis ; agent principal de la tuberculose chez l'homme et certaines espèces plus rares comme M. bovis et M. africanum. L'ensemble de ces espèces forme le complexe de mycobactéries tuberculosis. Il existe également d'autres mycobactéries appartenant à la même famille mais qui ne font pas partie du complexe tuberculosis et responsables de plusieurs infections pulmonaires, cutanées, ganglionnaires et généralisées (Nicolas V., 2014). On les appelle mycobactéries atypiques ou mycobactéries non tuberculosis (MNT) et sont de croissance lente (Carbonelle et al, 2003 ; EL Helari et Vergez, 1993). La tuberculose est une pathologie infectieuse endémo épidémique causée par les mycobactéries du complexe tuberculosis (MCTB). Elle demeure un problème majeur de santé publique dans le monde. A l'échelle mondiale, l'OMS estime à deux milliards de personnes infectées par le bacille tuberculeux (OMS, 2006). Chaque année environ 9,4 millions d'entre elles font une tuberculose (TB) maladie, tandis que 3 millions en meurent, dont un quart chez des patients infectés par le VIH (Dye, 2006; OMS, 2006). Un tiers des cas surviennent sur le continent africain en raison de l'épidémie VIH (Dye, 2006 ; WHO, 2006) et plus de 95% de mortalité et morbidité s'observent dans les pays en développement (Sangaré et al, 2010). Dans la stratégie de lutte contre la TB sous DOTS et le partenariat Halte à la tuberculose, la microscopie directe est mise en exergue par l'OMS et l'Union Internationale contre la Tuberculose et les Maladies Respiratoires (UITMR) pour identifier les patients tuberculeux contagieux (Enarson, 2000). Elle est recommandée en priorité comme outil clé du diagnostic de la tuberculose (TB) dans les pays à faibles ressources chez les malades symptomatiques toussant et crachant depuis plus de deux semaines. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 2 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE Malgré le nouvel intérêt porté à la lutte antituberculeuse à l'échelon mondial, les mécanismes de résistance augmentent tandis que les options thérapeutiques s'amoindrissent. En septembre 2006, l'OMS alerte les professionnels de santé à propos de la menace des tuberculoses multi résistantes (TB-MDR). Le fardeau des TB-MDR augmente en effet de façon dramatique dans le monde, environ 500 000 cas chaque année parmi les nouveaux malades (WHO, 2008). Dans les pays industrialisés malgré le recul de l'endémie de la tuberculose, il s'est produit un regain considérable pour la tuberculose dans les années 90 en raison d'un arrêt brutal de la régression régulière de l'incidence de la maladie et de la montée de la résistance aux antibiotiques (Marie-Laure Uffredi et al, 2000). Outre la remobilisation des autorités politiques et des acteurs de santé publique, ce regain de la tuberculose a donné un coup de fouet à la recherche et a abouti à la mise au point de nouvelles techniques de diagnostic bactériologique essentielles dans la prise en charge de la maladie (Marie-Laure Uffredi et al, 2000). La tuberculose demeure à l'aube du troisième millénaire l'une des principales causes de mortalité par maladies infectieuses malgré l'arsenal thérapeutique disponible pour lutter efficacement contre cette maladie. Pour le cas spécifique du Burkina Faso, la tuberculose multirésistante (TB-MDR) est devenue une préoccupation majeure. Ces dernières années, le pays a enregistré une augmentation des cas de TB-MDR passant de 12 cas en 2007 à 27 cas en 2011. La lutte contre cette forme particulière de tuberculose passe par son diagnostic précoce chez les cas suspects à frottis-positifs pour leur prise en charge adéquate. C'est pourquoi, le laboratoire national de référence des mycobactéries (LNR) à Ouagadougou, a été équipé en Thermocycleur GTQ-Cycler96 pour la technologie DNA-STRIP et Gene Xpert MTB/RIF en fin 2012 et courant 2013 respectivement pour réaliser les tests de diagnostic rapide (le test GenoType MTBDR plus ver.2 et le test Xpert MTB/RIF). A partir de 2013, une stratégie de collecte et d'acheminement des crachats au LNR a été instituée systématiquement dans un groupe restreint de patients (les cas d'échec du traitement, rechute, cas contact de TB-MR, les reprises après abandon de traitement et les contrôles positifs au 3e mois de traitement de 1e ligne) dans les centres de diagnostic et de traitement de la tuberculose (CDT) des 13 régions sanitaires du pays. Actuellement il n'y a pas de données publiées sur le nombre de cas TB-MR/RR détectés parmi les catégories de malades soumis au dépistage (Diande et al, 2009). Cette information justifie la présente étude qui a pour objectif d'évaluer la proportion des cas de tuberculose résistante à la rifampicine et/ou à l'isoniazide selon les caractéristiques sociodémographiques et cliniques parmi les malades dont les échantillons ont été analysés au Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 3 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE Laboratoire National Référence des mycobactéries. Les généralités sur les mycobactéries, la tuberculose et la résistance seront traitées dans la première partie de ce document. Notre étude proprement dite fera partie de matériel et méthode qui sera la deuxième partie suivie des résultats. DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE GENERALITES Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 4 Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 5 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE I. GENERALITES SUR LES MYCOBACTERIES D'après le Bergey's manual (Murray et al, 1989), le genre mycobacterium est le seul genre de la famille des Mycobacteriacae. Il comporte trois grands ensembles des mycobactéries : ? les mycobactéries pathogènes du complexe tuberculosis qui regroupe les espèces: Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. cannettii, M. caprae, M. micoti, M. pinnipeddii (Radomski, 2012), ? les mycobactéries pathogènes n'appartenant pas au complexe tuberculosis : M. leprae (aussi nommé bacille de Hansen ou Bacterium leprae) responsable de la lèpre, le M. ulcerans responsable de l'ulcère de Burili, le M. marinum responsable de granulome aquarium et le M. abscessus ( wikipedia.org/wiki/Mycobacterium), ? les mycobactéries non-tuberculeuses encore connues sous le nom de mycobactéries atypiques ou encore mycobactéries environnementales potentiellement pathogènes (Potentially Pathogenic Environmental Mycobacteria : PPEM) (Inderlied et al, 1993 ; Caruso et al, 2009). On compte plus de 100 espèces des Mycobactéries et seulement trois espèces sont pathogènes pour l'homme, d'autres le sont mais occasionnellement ou en cas d'immunodépression locale ou systémique (DOSSO Mireille, 2007). Environ 138 espèces et 11 sous espèces de mycobactéries ont été répertoriées ( www.bacterio.cict.fr). 2.1. Classification des Mycobactéries Les mycobactéries appartiennent à la famille des Mycobacteriaceae, dans l'ordre des actinomycétales, au genre Mycobacterium. Le principal point commun à toutes ces espèces appartenant au genre Mycobacterium dans l'ordre des actinomycétales, est la propriété tinctoriale pathognomonique mise en évidence par la coloration de Ziehl-Neelsen : l'acido-alcoolo-résistance (DOSSO Mireille, 2007). Toutes les mycobactéries sont des BAAR mais toutes les BAAR ne sont pas des mycobactéries. Car les nocardia, quelques corynébactéries et actinomycètes sont faiblement acido-résistants (Carbonelle et al, 2003). 2.1.1. Mycobactéries du complexe tuberculosis Les Mycobactéries du complexe tuberculosis constituent un groupe très compact et ses membres M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. pinipedi, M. caprae et M. microti peuvent être considérés comme des sous- espèces de M. tuberculosis (Dominique Labie, 2003). Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 6 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE 2.1.2. Mycobactéries atypiques Selon la classification de Runyon basée sur les caractères phénotypiques qui sont la pigmentation, la température optimale et la vitesse de croissance ; quatre groupes se distinguent dans les mycobactéries atypiques (DOSSO Mireille, 2007) : - groupe I, II et III regroupe les espèces pathogènes strictes ou opportunistes et à croissance lente (DOSSO Mireille, 2007): V' groupe I des mycobactéries photochromogènes que sont: M. kansasii, M. marinum, M. simiae, M. asiaticum V' groupe II des mycobactéries scotochromogènes: M. gordonae, M. szulgai, M. scrofulaceum, M. flavescens V' groupe III des mycobactéries non chromogènes qui comprend le complexe aviaire (M. avium, M. intracellulaire et M. xenopi), le complexe terrae (M. non chromogenicum, M. trivial, M. gastri M. malmoense) et d'autres espèces telles que M. ulcerans, M. shimodei, M. paratuberculosis, M. lepraemurium et M. farcinogène. - groupe IV qui regroupe des espèces pathogènes rares ou saprophytes et à croissance rapide (DOSSO Mireille, 2007) : V' espèces non pigmentées : M. fortuitum, M. chelonei, M. fallax, M. senegalensis, M. chitae ; V' espèces pigmentées : M. vaccae, M. vaccae-aurum, M. engloaecki V' espèces thermophiles : M. phlei V' espèces thermoresistibles : M. smeggmatis. 2.2. Caractères morphologiques Les mycobactéries sont des bacilles droits ou légèrement incurvés de 0,2 à 0,6um de diamètre sur 1,0 à 10,0um de longueur présentant parfois des ramifications ou de renflements formant des filaments qui se fragmentent très facilement en
éléments bacillaires Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 7 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
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Figure 1 : M. tuberculosis vue en microscopie électronique (Demangeat et al, 2013). 2.3. Caractères structuraux
Figure 2 : Schémas des enveloppes cellulaires des mycobactéries ( www.microbia.free.fr). Les mycobactéries présentent des caractères structuraux très complexes. Leur paroi est formée de l'intérieur vers l'extérieur d'une bicouche lipidique, d'une bicouche formée d'un polymère (de molécule d'arabinose, de galactose et d'acides mycoliques) et d'une seconde bicouche lipidique (www.wikipedia/Mycobacteriumtuberculosis). Cette paroi est épaisse d'environ 10 à 20umet le génome entièrement séquencé. L'espèce M. tuberculosis a un "chromosome" circulaire de 4 411 529 paires de bases (GC = 65,6%), 3924 gènes. Un gène particulier semble essentiel au pouvoir pathogène chez l'homme, gène absent chez le BCG et M. microti. Il s'agit d'un gène codant pour une protéine ESAT-6, sécrétée par la bactérie et déclenchant une forte production d'INF-Gamma (Cole S.T et al, 1998). Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 8 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE 2.4. Caractères culturaux Selon les espèces, les exigences et le temps de génération des mycobactéries sont variables : les colonies ne sont visibles qu'après un temps d'incubation compris entre 2 jours et 10 semaines à 37°C en aérobiose (les mycobactéries sont aérobies strictes) ( www.microbia.free.fr). En fonction de leur vitesse de croissance et de leurs exigences, les espèces du genre mycobacterium sont divisées en 2 groupes: - les mycobactéries à croissance lente (incluant les mycobactéries responsables de la tuberculose), ne formant des colonies qu'après au moins 7 jours de culture sur milieu enrichi à l'oeuf coagulé (Löwenstein-Jensen) et incapables de cultiver sur des milieux standards ; - les mycobactéries à croissance rapide, formant des colonies en moins de 5 jours et aptes à se développer sur gélose trypticase soja. Les colonies apparaissent en 15 jours ou trois semaines après culture sur le milieu Löwenstein-Jensen et sont caractéristiques, rugueuses, verruqueuses et de couleur belge eugonique (Anne Decoster, 2014). Il convient de noter que M. leprae n'est pas cultivable sur milieu de culture. II. TUBERCULOSE La TB est une pathologie infectieuse très ancienne endémo-épidémique dont l'unité nosologique et la cause effective n'ont été connues qu'à partir du XIXe siècle. Le principal agent causal est le M. tuberculosis qui résulte d'une contagion d'homme à homme bien que le M. bovis peut également être à la base de la tuberculose humaine. Mais il s'agit d'une zoonose suite à une consommation du lait non pasteurisé (Rittaco V et al 1992). 3.1. Physiopathologie La tuberculose est dans plus de 70% des cas pulmonaire et n'entraîne aucune manifestation clinique dans un premier temps. Les bacilles sont inhalés par voie aérienne et se disséminent ensuite dans d'autres organes par le courant sanguin, le système lymphatique ou par extension directe. On dit que le sujet fait une « primo-infection tuberculeuse (PIT) » latente qui est caractérisée par différents évènements dont l'intensité varie selon les caractéristiques de l'hôte (principalement l'âge et l'état immunitaire). Ces évènements peuvent être : ? un chancre d'inoculation : qui se traduit par la fixation des bacilles dans un lobe pulmonaire. Il se produit une réaction inflammatoire où les bacilles dans les macrophages vont se multiplier et détruire ainsi ces macrophages et atteindre d'autres. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 9 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE Les bacilles utilisent une protéine particulière appelée TACO pour provoquer l'inhibition de la fusion phagosome-lysosome et pouvant limiter l'acidification due à la pompe à protons du phagosome. ? adénopathie : c'est la dissémination des bacilles dans les ganglions puis vers l'ensemble de l'organisme du sujet primo-infecté. Ce dernier développe une hypersensibilité à la tuberculine avec activation des lymphocytes T killer. ? une formation de follicule : se caractérise par une stimulation active et efficace des macrophages contre les bacilles qu'ils vont attaquer. Les macrophages se transforment en cellules multinucléées qui entourent le chancre d'inoculation formant un follicule ou granulome où a lieu la "caséification" appelée nécrose solide comme dans le fromage sous l'action du "Tumor Necrosis Factor" ou TNF alpha. Au fur et à mesure que les mécanismes de défense de l'hôte entrent en jeu, des tubercules commencent à se former. Une lésion apparaît au point de pénétration et les ganglions lymphatiques afférents augmentent de volume, l'ensemble formant le "complexe tuberculeux primaire" (Myint et al, 1987). La PIT donne dans moins de 10% de cas, des signes cliniques ou radiologiques ; on parle d'une PIT patente [Guide de lutte antituberculeuse 2006]. Lorsqu'elle n'est pas traitée ou traitée avec négligence, la tuberculose peut devenir résistante, multirésistante ou ultrarésistante. 3.2. Tuberculose résistante, multirésistante ou ultrarésistante La tuberculose est résistante lorsque l'agent causal développe une résistance à un seul médicament antituberculeux de première ligne ; la rifampicine généralement. Elle est dite multirésistante lorsque la bactérie résiste à l'isoniazide (INH) et à la rifampicine (RMP) qui sont deux des médicaments de première ligne utilisés dans le traitement de la tuberculose pulmonaire à frotti positif ( www.theunion.org). Selon l'OMS, une résistance supplémentaire aux fluoroquinolones (FQ) et à au moins un médicament antituberculeux injectable de deuxième ligne dans le traitement (capréomycine (CPM), kanamycine (KM) ou amikacine (AMK)) associée à la multirésistance donne une ultrarésistance ( www.theunion.org). 3.3. Cause d'une tuberculose résistante/multirésistante La tuberculose multirésistante est toujours consécutive à une erreur humaine, notamment lorsqu'une personne ne suit pas son traitement jusqu'à son terme. Les principales causes de la tuberculose multirésistante sont: la prescription médicale inadaptée, la mauvaise qualité des médicaments antituberculeux, l'interruption du traitement, l'absence de programmes Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 10 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE nationaux de lutte contre la tuberculose, le manque de recommandations standardisées, la surveillance insuffisante des professionnels de santé et l'arrêt précoce du traitement ( www.european-lung-foundation.org). Si la tuberculose multirésistante n'est pas envisagée ou diagnostiquée, les mycobactéries résistantes auront tout le temps de se développer et de contaminer d'autres personnes de la communauté, entraînant une aggravation du problème. 3.4. Epidémiologie La tuberculose reste un problème de santé publique majeur. Pour l'année 2012, on estime que 8,6 millions de personnes ont contracté cette maladie et que 1,3 million en sont morts soit 15,11% (y compris 320 000 décès parmi les personnes séropositives pour le VIH) (rapport OMS, 2013). Le nombre de décès par tuberculose est inacceptablement élevé sachant que la plupart d'entre eux sont évitables. La tuberculose multirésistante progresse considérablement avec 440.000 nouveaux cas chaque année causant au moins 150.000 cas de décès chaque selon l'OMS ( www.masantefacile.com). L'un des pays les plus touchés au monde est l'Inde où on estime entre 125 à 299 nouveaux cas pour 100 000 habitants soit 26% du total suivi de la Chine où 50 à 124 nouveaux cas pour 100 000 habitants sont estimés soit 12% du total. L'Afrique enregistre les taux les plus élevés des nouveaux cas avec plus de 300 pour 100 000 habitants. Les objectifs du millénaire pour le développement (OMD) consistent à réduire de 50% le taux de mortalité (par rapport à 1990) et à inverser la tendance concernant l'incidence de la tuberculose d'ici 2015 (rapport OMS, 2013). En 2012 à l'échelle mondiale, le taux de mortalité par tuberculose avait régressé de 45% depuis 1990. Deux régions OMS ont déjà atteint les objectifs : la région des Amériques et celle du Pacifique occidentale. En 2009, le Burkina Faso a enregistrés environ 3061 nouveaux cas TPM+ soit une augmentation de 11% du nombre de cas diagnostiqués en 2008 qui était de 2724 (Guide de Lutte antituberculeuse 2008). La tuberculose dans le monde en 2012 a touché plus de 8 millions de personnes avec environ 1,3 millions qui en sont décédées soit 15,6%. L'OMS estime qu'il n'y aurait pas de nouveau vaccin avant 2025. Mais un nouveau traitement de tuberculose multirésistante est mis au point par la bédaquiline qui est un diarylquinoline. La figure ci-dessous présente la tuberculose dans le monde en 2012. Le pays le plus touché au monde est l'Inde avec 2,2 million soit 26% du total suivi de la Chine qui présente 12% du total. En Afrique, l'incidence la plus élevée des nouveaux cas pour 100.000 habitants est observée dans les pays du sud du continent. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 11 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
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Figure 3 : Tuberculose dans le monde 2012 ( www.masantefacile.com). 3.5. Transmission La tuberculose se propage par voie aérienne. Lorsque le malade tousse ou éternue, il produit de fines gouttelettes appelées gouttelettes de "pflüge". Ces gouttelettes se fixent à des petites particules dans l'air. Un sujet saint peut s'infecter en inhalant ces particules. Le mode de transmission est presqu'exclusivement par voie aérienne. La transmission par voie digestive, par ingestion d'aliments d'origine animale (lait par exemple) est peu fréquente. Il existe également des transmissions par voie sexuelle urogénitale mais qui sont d'une très faible importance épidémiologique ( www.fares.be). L'image ci-dessous montre un malade tuberculeux qui après avoir toussé (voir éternué) émet les fines gouttelettes de "pflüge" et une personne saine qui en respirant inhale cet air contaminé. La transmission est exclusivement par voie aérienne.
Figure 4 : Transmission de la tuberculose ( www.textbookofbacteriology.net) Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 12 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE 3.6. Symptômes Les symptômes de la tuberculose sont peu spécifiques et varient en fonction de sa localisation. En cas d'atteinte pulmonaire, on peut observer une toux persistante (>3 semaines), des expectorations parfois sanguinolentes, une difficulté respiratoire et des douleurs respiratoires, des symptômes généraux tels que : la fièvre prolongée, anorexie, amaigrissement et sueurs nocturnes ( www.fares.be). En cas d'atteinte extrapulmonaire les signes dépendent de l'organe affecté. Les symptômes sont discrets voire inexistants et la maladie peut passer totalement inaperçue. 3.7. Diagnostic de la tuberculose Le diagnostic de la tuberculose repose sur la mise en évidence des BAAR dans les produits biologiques (crachats, urines, pus, LCR...). L'examen microscopique reste la technique la plus abordable pour le diagnostic direct de la tuberculose. Deux méthodes sont communément utilisées pour cette mise en évidence : la méthode de Ziehl Neelsen qui utilise la microscopie optique pour la lecture des BAAR et la méthode de Dugommier qui repose sur la coloration à l'auramine et qui utilise la microscopie à fluorescence. D'autres méthodes de mise en évidence sont également utilisées pour observer la croissance de ces mycobactéries et détecter leur sensibilité aux médicaments antituberculeux. La microscopie des sécrétions bronchiques est peu sensible parce qu'elle nécessite un nombre important de bacilles (104 BAAR/ml de crachat pour la technique de Ziehl-Neelsen) dans le prélèvement pour être positif (Diande S., 2010). En outre, il faudra retenir que l'acido-alcoolo résistance est spécifique des mycobactéries mais pas des bacilles de la tuberculose. 3.7.1. Examen direct a) Coloration de Ziehl Neelsen La technique de coloration de Ziehl Neelsen est la technique de référence dans le diagnostic direct de la tuberculose. Ses composantes sont la fuchsine, l'alcool-acide et le bleu de méthylène. La fuchsine colore en rouge les bacilles qui conservent cette coloration après traitement par l'acide nitrique (ou sulfurique) dilué et par l'alcool. Le fond de la préparation est ensuite coloré au bleu de méthylène. Les BAAR apparaissent rouges sur fond bleu. La lecture se fait à l'objectif x100 à immersion. Elle est longue car le champ observé est petit. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 13 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
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Figure 5 : M. tuberculosis en microcopie optique ( www.microbia.free.fr). b) Coloration de Dugommier La méthode de Dugommier est la technique de lecture par fluorescence. Ses composantes sont l'auramine, l'acide-alcool et le permanganate de potassium. L'auramine se fixe sur le bacille et le rend fluorescent, après traitement à l'acide-alcool et contre-coloration du fond par le permanganate. La préparation est examinée au microscope à fluorescence (x25). La lame est explorée plus rapidement, le champ observé étant plus grand qu'à l'immersion. Les BAAR apparaissent fluorescents, brillants sur fond noir de la préparation. Ils sont dénombrés par champ microscopique (diagnostic positif si au moins un BAAR pour 10 champs observés).
Figure 6 : M. tuberculosis vue en microscopie à fluorescence ( www.microbia.free.fr). 3.7.2. Culture Les prélèvements respiratoires (crachats, tubage, liquide pleural...), les urines et d'autres types de prélèvements biologiques doivent être décontaminés avant d'être ensemencés dans les milieux de culture riche et sélectifs pour les mycobactéries. La culture permet de comprendre la vitesse de croissance de mycobactéries et plusieurs milieux sont disponibles pour la réalisation. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 14 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE a) Différents milieux de culture Les milieux solides sélectifs à l'oeuf coagulé de Löwenstein-Jensen et de Coletsos définissent les caractères culturaux classiques de M. tuberculosis: colonies rugueuses de couleur chamois apparaissant sous l'aspect de "verrue" ou de "chou-fleur" en 3 semaines environ après incubation à 37°C en atmosphère ambiante. Les délais sont de 6 à 8 semaines pour les M. afrcanum et M. bovis (Mode opératoire-culture des mycobactéries, 2003). Quelques milieux solides de culture V' Milieu de Löwenstein-Jensen V' Milieu de Löwenstein-Jensen + 0,2% de pyruvate de sodium V' Milieu de Coletsos - Les milieux sélectifs liquides qui permettent une réduction du délai de détection des colonies en quelques jours pour les prélèvements riches en bacille et à un peu plus de 2 semaines pour ceux paucibacillaires. Sur ces milieux, M. tuberculosis apparait sous la forme de longues "cordes" mises en évidence par la coloration de Ziehl-Nelseen. Nous pouvons citer quelques-uns de ces milieux : V' Milieu de Middlebrook V' Milieu Bactec* 460 TB V' Milieu BBL* MGIT V' Milieu MB/Bact TTM - D'autres milieux dits milieux diphasiques sont proposés tel le Milieu BBL*Septi-Check AFB (Mode opératoire-culture des mycobactéries, 2003) L'identification classique des M. tuberculosis à partir des cultures repose sur la morphologie des colonies, sur leurs propriétés physiologiques telle la production d'acide nicotinique et sur l'effet d'antibiotiques (bactériostase) comme l'acide para-amino-salicylique (Anne Decoster, 2007). La figure suivante montre une culture positive de BK sur milieu solide de Löwenstein Jensen. Les colonies apparaissent en chou-fleur.
Figure 7 : BCG sur Löwenstein Jensen (chou-fleur) ( www.recherche-fr.com/bk). Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 15 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE b) Vitesse de croissance Sur des milieux de culture à température optimale, deux types de mycobactéries peuvent être considérés; les mycobactéries à croissance rapide et les mycobactéries à croissance lente. La croissance lente nécessite 7 jours à 3 mois de culture pour voir apparaitre des colonies (Runyon, 1959). Ces colonies ont un temps de génération compris entre 12 heures et 24 heures. Tandis que les mycobactéries à croissance rapide ont un temps de génération compris entre 2 heures et 6 heures avec formation des colonies en moins de 7 jours. 3.7.3. La Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) Dans le diagnostic de la tuberculose, la Réaction de Polymérisation en Chaîne des Mycobactéries est une des nouvelles techniques mises au point pour détecter la résistance aux antituberculeux. Elle repose sur la caractérisation des séquences d'acides nucléiques amplifiés puis hybridés à l'aide des sondes (Loiez-Durocher et al, 2000). La PCR s'applique sur des échantillons de culture à MCTB positive (>108 bacille/ml), de prélèvement BAAR à microscopie positive (> 105 bacille/ml) ou prélèvement BAAR à microscopie négative-culture positive (>0 à 104 bacille/ml) (Emmanuel C., 2010).
Le test Xpert MTB/RIF est une réaction de polymérisation en chaîne à temps réel. La détection moléculaire simultanée du MTBC et des mutations du gène rpoB associé à une résistance à la rifampicine accélère significativement le diagnostic de tuberculose sensible aux médicaments comme celle de tuberculose multirésistante. Le test Xpert MTB/RIF permet de réaliser cette détection en moins de 2 heures dans des produits biologiques (expectorations traitées avec le réactif) ou culots de centrifugation d'un prélèvement traité avec la méthode de décontamination décrite par Kubica (N-Acétyl-L-Cystéine + soude) (Moris SL et al, 1995). Ce test réalisé de façon automatique avec un système informatique est constitué : d'un PC (Personal Computer) doté d'un logiciel préinstallé pour la lecture des échantillons, des DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A RISQUE DE TUBERCULOSE RESISTANTE A LA RIFAMPICINE ET/OU A L'ISONIAZIDE AU BURKINA-FASO cartouches jetables et à usage unique, d'un lecteur code-barres et d'un appareil de lyse ultrasonique MTB-RIF test platform qui reçoit les cartouches Xpert.
Appareil de lyse ultrasonique MTB-RIF PC Cartouche Lecteur code-barres Figure 8 : composantes du test Xpert MTB/RIF (www.tbonline.info). Principe de la procédure Le test Xpert MTB/RIF comprend les réactifs pour la détection des mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis et pour la résistance à la rifampicine, ainsi qu'un contrôle du traitement de l'échantillon permettant de s'assurer du traitement approprié des bactéries cibles, ainsi que de la présence d'inhibiteur(s) lors de la réaction PCR (Moris et al, 1995). Le contrôle de la sonde consiste à vérifier la réhydratation des réactifs, le remplissage des tubes de PCR dans la cartouche, l'intégrité de la sonde et la stabilité du fluorochrome. Les amorces du test Xpert MTB/RIF amplifient un fragment de 81 paires de bases correspondant à une région connue du gène rpoB. Les sondes identifient les mutations responsables d'une résistance à la rifampicine de la région étudiée par comparaison avec la séquence sauvage de référence. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 16 Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 17 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE c) GenoType MTBDR plus ver 2. Le test GenoType MTBDR plus est un test d'hybridation moléculaire sur bandelettes pour la détection de la résistance et de la multirésistance aux antituberculeux. Cette technique d'hybridation moléculaire sur bandelette est simple à mettre en oeuvre avec du matériel présent dans beaucoup de laboratoires de bactériologie (thermocycleur et bain-marie) (Truffot-Pernot et al, 2010). Deux types de bandelettes ont été mis sur le marché pour ce test moléculaire : la bandelette InnoLipa Rif TB® (Innogenetics) et la bandelette GenoType®MTBDR plus ver.2 (Hain Science) (Truffot-Pernot et al, 2010). Les deux types de bandelette permettent la détection de la résistance à la rifampicine, mais la deuxième bandelette (bandelette GenoType®MTBDR plus ver.2 (Hain Science)) est utilisée pour la mise en évidence des MDR. Sur la bandelette InnoLipa Rif TB® (Innogenetics) sont fixées à : - des sondes spécifiques des allèles sauvages gène rpoB de la position 315 du gène katG et des positions -8, -15 et -16 du régulateur du gène inhA - des sondes spécifiques des mutations les plus fréquemment en cause dans la résistance à la rifampicine (S531 L, H526 Y, H526 D, et D516 V de rpoB) et à l'isoniazide (deux triplets déterminant la mutation S315 T de katG et -15C?T, -16A ?G, -8T ?C, - 8T ?A de inhA). Les 2 figures ci-dessous sont des exemples de bandelettes InnoLipa Rif TB® (Innogenetics) et GenoType®MTBDR plus ver.2 (Hain Science).
Figure 9a : Principe de la recherche de mutation dans
le gène rpoB par hybridation Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 18 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE
Figure 9b : exemple de bandelette GenoType®MTBDR plus ver.2 (Hain Science). Sur la bandelette GenoType® MTBDR plus ver.2 sont inscrits les différents gènes codant pour les deux antituberculeux majeurs (Rifampicine et Isoniazide) : les gènes rpoB, katG et inhS qui sont des gènes codant pour l'ARN de la bactérie. Ils doivent apparaître sur la bandelette afin de confirmer la bonne réalisation de PCR et la présence des gènes pouvant traduire la résistance ou la sensibilité à la rifampicine et/ou à l'isoniazide : ? le rpoB WT, au nombre de 08 et représentent les souches sauvages (white type) des mycobactéries dans la résistance à la rifampicine. ? le katG WT et inhS WT : sont les gènes désignant la souche sauvage dans la résistance à l'isoniazide ? le rpoB Mut, gènes des souches mutantes de la bactérie, leur présence confirme qu'il y a eu résistance à la rifampicine. ? de même, quand les traits apparaissent devant katG Mut et inhS Mut, cela explique qu'il y a résistance à l'isoniazide. d) Mécanisme de résistance La résistance acquise aux antibiotiques est toujours liée à des mutations chromosomiques qui codent soit pour les protéines cibles de certains antibiotiques ou soit pour des enzymes impliquées dans l'activation de l'antibiotique en substance active : Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 19 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE - La rifampicine est l'un des antituberculeux clé de la chaîne thérapeutique de la tuberculose. Sa cible principale est la sous-unité bêta de l'ARN polymérase codée par le gène rpoB (Loiez-Durocher et al, 2000). La résistance à la rifampicine est liée à des mutations dans une région restreinte du gène rpoB, qui s'étend du codon 511 au codon 533. - En ce qui concerne l'isoniazide, au moins trois gènes sont impliqués dans sa résistance : y' Le premier est le gène katG impliqué dans 50 à 60% des cas et codant pour l'enzyme catalase peroxydase de M. tuberculosis (Heym et al, 1995). y' Un deuxième gène impliqué dans 10 à 20% de résistance à l'isoniazide. C'est le gène inhA qui code pour l'enoylacyl carrier protein, protéine impliquée dans l'élongation des acides gras et dans la biosynthèse des acides mycoliques (Banerjee et al, 1994). y' Le troisième est le gène ahpC qui code pour l'alkyl peroxyde reductase. - L'éthambutol a pour cible l'arabinosyl transférase codée par trois gènes organisé en un éperon embCAB de 10 kb. Dans l'étude de Telenti et al, des mutations du gène embB sont identifiées chez 70 % des souches résistantes (Telenti A et al, 1997). - L'introduction du pyrazinamide dans la polychimiothérapie de première ligne a permis de réduire la durée de traitement de 9 mois à 6 mois (Loiez-Durocher et al, 2000). - Enfin la streptomycine qui est un antibiotique de la classe des aminosides a pour cible la sous-unité 30S du ribosome qui comporte l'ARNr16S codé par le gène rrs et la protéine ribosomiale S12 codée par le gène rpsL (Honoré N et al, 1994 ; Meier A et al, 1994). 3.8. Support génétique de résistance chez les mycobactéries La résistance aux antibiotiques est programmée dans le génome bactérien. Les modifications génétiques responsables de la résistance sont chromosomiques, secondaire à une mutation, une délétion ou une insertion portant sur le chromosome. Ces modifications peuvent également être extra-chromosomiques par acquisition de gènes (Anne Decoster, 2004). Les mutations chez les mycobactéries sont ponctuelles dans la région 507-533 du gène rpoB codant la sous-unité beta de l'ARN polymérase. La modification de la séquence nucléotidique d'un gène chromosomique (Emmanuel C., 2014) : Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 20 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE
L'image ci-dessus est le tableau des mutations du gène rpoB chez M. tuberculosis dans la région 507-533. 3.9. Traitement de la tuberculose Le traitement de la tuberculose n'est engagé qu'après confirmation à l'examen microscopique dépistant une tuberculose. L'OMS recommande une stratégie thérapeutique standardisée basée sur le DOTS (OMS, 1997). La streptomycine fut le premier antituberculeux actif mis en place. De nos jours, cinq antibiotiques dits de 1ère ligne sont utilisés dans le traitement efficace de la tuberculose: le pyrazinamide, l'isoniazide, l'éthambutol, la rifampicine et la streptomycine. Ces antibiotiques sont utilisés en polychimiothérapie. Un guide d'entretien et de prise en charge est proposé dans nos annexes. 3.10. Traitement et prise en charge de la tuberculose
multirésistante Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 21 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE La prise en charge se fait dans les structures spécialisées (PPH) au niveau des CHU et un patient qui n'est plus bacillifère peut être confié au niveau des CMA/CHR pour son suivi (Guide technique de lutte contre TB, 2011). Un algorithme de prise en charge en ambulatoire dans les CHU, CMA a été proposé dans les annexes. III. TUBERCULOSE ET CO-INFECTION VIH 4.1. Physiopathologie Le VIH entraîne une immunodépression importante avec un déficit cellulaire de CD4 et une baisse de cytokines (IFN-y, IL2, TNF) (Kassi A., 2007). Ce terrain permet une croissance accrue des mycobactéries avec risque de réactivation conduisant à une tuberculose maladie (production de TNF-á, IL-6, IL-1/granulome). Le résultat final est l'augmentation importante de la charge virale locale et systémique, risque d'évolution vers le stade SIDA (Kassi A., 2007). 4.2. Epidémiologie de la co-infection L'OMS estime en 2000 que 11,5 million de personnes ont fait une co-infection tuberculose VIH. Environ 70% en Afrique subsaharienne, 20% en Asie, et 4% en Amérique latine et aux Caraïbes (OMS, 2004). Le VIH accroit la vitesse de progression vers une infection de la tuberculose. Avec un statut VIH+, une personne est capable de développer une tuberculose maladie dans 50% des cas. 4.3. Conséquence de la co-infection En Afrique subsaharienne, un tiers ou plus des personnes infectées par le VIH sont susceptibles de développer une tuberculose (OMS, 2004). Un sujet atteint du VIH présente 10 fois plus de risque de développer une tuberculose maladie et la séroprévalence est d'environ 75% chez les sujets atteints de tuberculose. La conséquence majeure de la co-infection est l'augmentation de taux de mortalité par la tuberculose. 4.4. Actions conjointes TB/VIH (OMS, 2004) La tuberculose est une des premières causes de décès évitable chez les PvVIH. Pour atténuer ce double fardeau, l'OMS a élaboré une politique en 2004 qui permet de mener des activités conjointes afin de lutter contre la co-infection tuberculose VIH. Cette politique consiste à: - mettre en place et renforcer les mécanismes de collaboration pour la prestation de services intégrés tuberculose VIH - réduire la charge tuberculeuse chez le PvVIH et commencer rapidement le traitement antirétroviral - réduire la charge du VIH chez les patients présumés ou diagnostiqués tuberculeux DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE MATERIEL ET METHODES Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 22 Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 23 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE I. CADRE ET POPULATION DE L'ETUDE Notre stage de fin de cycle s'est déroulé pendant 12 mois au sein du laboratoire du Centre National de Lutte Antituberculeuse (CNLAT) de Ouagadougou. Le CNLAT est un centre de lutte contre la tuberculose qui a créé en 1969 au Burkina-Faso. Premièrement connu sous le nom du Centre de Coordination de Lutte Antituberculeuse (CCLAT) ; il devient ensuite le Centre National de Lutte Antituberculeuse (CNLAT) en 1982. La population de notre étude est constituée d'hommes et de femmes de 15 à 65 ans en provenance des 13 régions du Burkina-Faso. Les échantillons ont été collectés à partir des CDT des 13 régions sanitaires du Burkina-Faso. a. Type d'étude Notre avons mené une étude transversale analytique au laboratoire du CNLAT d'octobre 2013 en octobre 2014.
Les types de malades suivants ont été inclus dans l'étude : - Les cas de rechute : ce sont des patients déjà traités pour une tuberculose, déclarés guéris et qui reviennent avec une tuberculose confirmée bactériologiquement (frottis positif ou culture positive) (Guide technique de lutte contre TB, 2011) ; - les cas d'échec du traitement de 1ère ligne. Ces types de patients sont ceux dont l'examen de crachat est positif au 5ème ou 6ème mois de traitement ; Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 24 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE - les cas d'échec de retraitement : sont les malades tuberculeux dont l'examen de crachat confirmé par un second examen est positif à 5 mois ou plus tard au cours d'un retraitement de 8 mois donné sous la supervision directe d'un agent de santé. (Guide technique de lutte contre TB, 2011) ; - la reprise de traitement : c'est ceux qui ont interrompu leur traitement pendant 2 mois consécutifs ou plus et qui reviennent avec une preuve bactériologique de tuberculose (frottis positif ou culture positive) (Guide technique de lutte contre TB, 2011) ; - les contrôles positifs au 3ème mois de traitement de 1ère ligne ; - les cas contacts de TB-MR : ce sont les sujets en contact avec un patient TB-MR. II. Analyses bactériologiques
a) Décontamination Les expectorations ont été décontaminées par la soude 4% (NaOH4%) selon la méthode de Petroff modifiée. Environ 5 ml de crachat sont prélevés dans un flacon stérile de type Falcom dans lequel on mélange 2 fois le volume de NaOH 4%. Le flacon refermé hermétiquement on a agité puis homogénéiser. Ensuite les tubes ont été incubés à 37 °C pendant 30 min. La décontamination a été suivie de la neutralisation à l'eau distillée puis après centrifugation à 3000 trs/min pendant 15 min le culot est recueilli. On a ajouté ensuite 4 ml d'eau distillée puis procéder à une nouvelle centrifugation ; le culot recueilli a été remis en suspension avant l'extraction d'ADN pour réaliser le test GenoType MTBDR plus ver.2. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 25 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE
Le thermocycler GTQ cycler 96 allumé et les réactifs de révélations ont été portés à température ambiante dans le bain-marie. Nous avons ensuite choisi le type de test à réaliser avec le GTQ cycler 96, le volume et le nombre d'échantillons à introduire ont été également précisés au niveau du thermocycler GTQ cycler 96. Les tubes PCR hermétiquement fermés (afin d'éviter l'échappement d'ADN), le bouton START a été appuyé pour lancer la PCR qui comporte les trois phases: la dénaturation (95° C), l'hybridation (50-60° C) et la polymérisation (72°). La première étape avec les trois phases a duré environ 3 heures, les tubes PCR ont été ensuite retirés du GTQ cycler 96 pour l'étape suivante. Les pipettes et la plaquette PCR (avec 12 puits) ont été nettoyées à l'éthanol 70%. Environ 20 uL de solution DEN (dénaturation) et 20 uL de l'amplicon ont été déposés dans chaque puits de la plaquette Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 26 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE PCR. On a mixé pendant 5min avant d'ajouter 1mL de HYB (solution d'hybridation) et homogénéiser doucement. Les DNA strip ou bandelettes ADN, numérotés de 1 à 11 + une bandelette annotée "C" pour le contrôle ont été placés en dans les différents puits de la plaquette PCR. Ensuite on a incubé pendant 30 min à 45° C. Après avoir aspiré complètement la solution HYB, 1 mL de solution STR a été ajouté puis on a incubé une deuxième fois pendant 15 min à 45° C. La solution STR a été aspirée complètement puis nous avons rincé pendant 1 min avec la solution de RIN. Les solutions CON-C et CON-D pour la révélation ont été préparées pour les 11 échantillons et le contrôle C. Environ 10 uL de CON-C + 990 uL de CON-D soit 12 mL de CON-D et 120 uL CON-C pour les 12 échantillons dans un tube stérile. On prélève ensuite le mélange de conjugué dilué (CON-C+CON-D) et distribuons environ 950 uL dans chaque puits. Après 30 min d'incubation, la solution conjuguée a été aspirée complètement avant de rincer avec 1 mL de RIN pendant 1 min et à l'eau distillée pendant 1 min. Nos résultats ont été interprétés par révélation sur les bandelettes PCR. ii. Test Xpert TB/RIF Le test Xpert TB/RIF repose sur la détection des mutations du gène rpoB impliqué dans la résistance à la rifampicine. La manipulation a été faite sous la hotte laminaire. Les tubes coniques ont été étiquetés et environ 5uL d'échantillons y ont été transférés. Pour neutraliser les germes opportunistes dans l'échantillon, nous avons ajouté 2ml de la solution de neutralisation déjà conditionnée dans la boite Xpert TB/RIF et nous avons bien agité avant de laisser reposer pendant 20 min dans un premier temps. Ensuite nous avons agité à nouveau et laisser reposer pendant 15 min. Le système d'utilisation du GeneXpert MTB/RIF est composé d'un appareil, d'un ordinateur personnel, d'un lecteur de code-barres et d'un logiciel préinstallé pour effectuer le test sur des échantillons prélevés et afficher les résultats. Ce système requiert l'utilisation des cartouches jetables et à usage unique GeneXpert contenant des réactifs PCR. Les cartouches de TB/RIF ont été déballés, étiquetés et on a distribué environ 5 uL de l'échantillon dans les cartouches. Les cartouches TB/RIF préparés ont été introduites dans l'appareil GeneXpert et le test est lancé à partir de l'ordinateur. Après 1 à 2 heures la lecture est faite. La photo ci-dessous montre les différentes étapes du test Xpert TB/Rif. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 27 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE
Figure 10: procédure de réalisation du test Xpert TB/RIF [Catharina C.B. et al 2010] III. Analyses statistiques Les données ont été saisies sur Excel avant d'être transférées sur SPSS 20.0 pour analyse. Le lien statistique entre la résistance et les différentes variables de l'étude a été établi grâce au logiciel Epi InfoTM7. La valeur statistique significative a été située à P?0,05. DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE RESULTATS ET DISCUSSION Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 28 Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 29 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE I. RESULTATS L'étude a été poursuivie sur 204 patients avec 166 (81,4%) patients de sexe masculin et 38 (18,6%) de sexe féminin d'âge moyen de 25 #177; 10 ans inclus dans les différents centres de santé des 13 régions du Burkina-Faso. Environ 99 patients soit 48,5% ont été soumis au test de dépistage VIH. L'âge des patients de l'étude est de 15 à plus de 65 ans, avec 144 (70,59%) d'hommes ayant un âge compris entre 15 et 54 ans et 35 (17,16%) de femmes ayant l'âge de 15 à 54 ans (d'âge moyen =25 ans#177; 10). Les types de malade ont été : cas de contage avec 2 hommes (0,98%) et 0% de femmes; cas M3+ avec 29 (14,22%) hommes et 7 (3,43%) femmes; les cas d'échec avec 76 (37,25%) hommes et 15 (7,35%) femmes; les cas de rechute 42 (20,59%) hommes et 12 (5,88%) femmes; les PDV avec 3 (1,47%) hommes et 0% de femmes et les cas non précisé avec 14 (6,86%) hommes et 4 (1,96%) femmes. Des 204 échantillons analysés : 170 (83,33%) MCTB et 34 (16,67%) MNT. Les mutations ont été observées au niveau des gènes rpoB sur 58 souches de MCTB soit 34, 12% des rpoB WT. Elles ont été au niveau des gènes katG et inhA sur 45 souches de MCTB soit 32,60% des katG WT et inhWT. Nos résultats ont été ceux des tests moléculaires : le test Xpert MTB/Rif et du GenoType MTBDR plus ver.2. Le même échantillon a été utilisé pour les deux tests et compte tenu de l'insuffisance de quantité de certains échantillons, les 170 échantillons ont été utilisés pour la réalisation du test Xpert MTB/Rif (test de résistance à la rifampicine) et 138 pour réaliser le test GenoType MTBDR plus ver.2 (test de multirésistance). Les tableaux suivants donnent les résultats de TB-RR/MDR répartie par sexe, âge, statuts VIH/TB, type de malades, et par régions. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 30 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE 1.1. Profil de résistance à la rifampicine par sexe Le profil de résistance à la rifampicine par sexe se traduit dans le tableau ci-dessous. R=Résistance, S=Sensible, M=Masculin, F=Féminin, N=Nombre de patients Tableau N° 1 : Répartition de la résistance à la rifampicine par sexe
Le Tableau1 ci-dessus nous donne la résistance à la rifampicine répartie par sexe. Au total, 141 souches des mycobactéries du complexe tuberculosis chez les hommes soit 82,94% et 29 souches chez les femmes soit 17,06%. La résistance à la rifampicine chez les patients de sexe masculin est 27,64% et 11 (6,47%) chez les femmes. La résistance à la rifampicine totale par sexe enregistrée pendant l'étude de la période fin 2012 début 2013, est d'environ 34,12%. 1.2. Répartition des cas de TB-MR par sexe Le tableau suivant est la répartition des MDR par sexe. Les MDR représentent 32,60% des cas enregistrés dans le tableau n02. Ce sont les résultats de la résistance à la rifampicine et/ou à l'isoniazide par sexe. Au total, 138 patients ont été enregistrés soit 81,17%. Le taux de TB-MR chez les hommes est de 26,08% et 6,52% chez les femmes. Tableau N°2: Répartition de la TB/MR par sexe
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RISQUE DE TUBERCULOSE 1.3. Répartition par tranche d'âge de la résistance à la rifampicine Le tableau ci-dessous, présente la répartition de la résistance à la rifampicine par tranche d'âge de moins de 15 ans à plus de 65 ans. La résistance totale à la rifampicine enregistrée est de 34,09% pour les 170 échantillons de l'étude. Les tranches d'âge de 24 à 34 et de 34 à 44 ans présentent les résistances à la rifampicine les plus élevées soit respectivement 14,70% et 10,58%. Tableau N03: Répartition par tranche d'âge de la résistance à la rifampicine Rif
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RISQUE DE TUBERCULOSE 1.4. La répartition des TB-MR par tranche d'âge Le tableau n04 donne les cas de TB-MR répartis dans les tranches d'âge de moins de 15 ans à plus de 65 ans. Tableau N°4 : La répartition des TB-MR par tranche d'âge MR
Le taux global de TB-MR est de 32,60%. Les taux de MDR les plus élevés sont observés dans les tranches d'âge de 24 à 34 ans avec 13,76% et 34 à 44%. 1.5. Profil de résistance à la rifampicine selon le statut VIH des patients Le tableau ci-après fait état de résistance à la rifampicine et de la co-infection TB/VIH. Tableau N° 5: Résistance à la rifampicine et la co-infection TB/VIH. RIF
On note dans le tableau n05 la proportion de patients VIH positif tuberculeux et résistants à la rifampicine qui est de 3,4%. Le nombre de patients co-infectés soumis au test de résistance à DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE la rifampicine est de 09 patients soit 10,22%. Le dépistage du VITT a été effectué sur 88 patients soit 51,76% de l'étude. 1.6. Répartition des cas de TB-MR selon leur statut VITT Le tableau ci-après est le résultat de la co-infection TB/VITT et les MDR Tableau N06: Les TB/MDR et co-infection TB/VITT
Le tableau ci-dessus est le récapitulatif des TB-MR répartis sur les patients soumis au dépistage VIH. Environ 64 patients soit 37,64% de l'étude. Il ressort du tableau que la proportion des patients Co-infectés TB/VITT est de 4,68%. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 33 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE 1.7. Profil de la résistance à la rifampicine selon le type de malade Le tableau ci-dessous est le profil de la résistance à la rifampicine selon le type de malade Tableau N07: Répartition de la résistance à la rifampicine par type de malade. RIF
Au vu du tableau n07, il ressort les différents types de malades inclus dans l'étude, les perdus de vue (PDV) et ceux dont le statut n'est pas précisé. La résistance la plus élevée est observée chez les patients en échec de traitement avec 17,65% suivi des cas de rechute avec 6,47% et ceux dont la microscopie est positive au 3ème mois de traitement 5,29%. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 34 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE 1.8. Répartition des cas de TB-MR par type de malade La répartition de TB-MR par type de malade est récapitulée dans le tableau suivant Tableau N08: Répartition des TB-MR par type de malade MDR
Le tableau n08 présente les MDR reparties par type de malades. Les cas d'échec ont une multirésistance plus élevée dans une proportion de 17,39% suivis des patients positifs en microscopie au 3ème mois de traitement 5,79% et des cas de rechute, environ 5,07%. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 35 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE 1.9. Répartition de la résistance à la rifampicine par région Le tableau ci-après est le tableau récapitulatif de la résistance à la rifampicine dans les 13 régions du Burkina-Faso. Tableau N09: Répartition de la résistance à la rifampicine par région RIF
Dans le tableau n09, les régions du Centre et des Hauts Bassins présentent respectivement les taux de résistance de 12,94% et 5,29%. Le résultat total de la résistance à la rifampicine des 13 régions du Burkina pendant la période d'étude est de 34,06%. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 36 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE 1.10. Profil de TB-MDR dans les différentes régions Le tableau suivant présente les différents taux de TB-MDR dans les 13 régions du Burkina-Faso. Tableau N010: Répartition des TB/MDR dans les différentes régions MDR
Au regard du tableau n010, il ressort que les régions du centre et des hauts bassins présentent les MDR les plus élevées ; soit 11,59% et 5,07%. Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 37 Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 38 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE II. DISCUSSION Dans l'objectif d'évaluer la proportion de cas de TB-MR/RR selon les caractéristiques sociodémographiques et cliniques des malades nous avions inclus 204 patients pour le diagnostic de tuberculose résistante à la rifampicine et multirésistante selon les variables suivantes : le sexe, l'âge, le statut VIH, le type de malade et la provenance géographique. Les isolats inclus 170 (83,33%) de MCTB et 34 (16,66%) de MNT. Deux tests moléculaires : le test Xpert TB/Rif et le GenoType MTBDR plus ver.2 ont été utilisés pour la mise en évidence de la résistance aux antituberculeux. La taille de l'échantillon était de 170 pour la réalisation du test Xpert TB/rif et de 138 pour réaliser le GenoType MTBDR plus ver2. Le test Xpert TB/Rif a été réalisé avant le GenoType MTBDR plus ver.2 et le même échantillon a été utilisé pour les deux tests. On se retrouve avec des patients dont seul le test Xpert TB/Rif est réalisé. L'infection VIH n'est pas liée à la résistante. Toutes fois, 88 échantillons (n=170) ont été soumis au test de la mise en évidence de la résistance à la rifampicine et 64 échantillons (n=138) pour le test GenoType MTB plus ver 2. La résistance à la rifampicine est plus élevée chez les patients de sexe masculin que chez les patients de sexe féminin. De même, les cas de MDR sont plus élevés chez les hommes que chez les femmes. Plus de patients masculins s'étaient présentés au laboratoire pour les cas M3+ (14,21%), cas d'échec (37,25%) et rechute (20,58%). Ceci pourrait expliquer les pourcentages élevés de résistance à la rifampicine et ou à l'isoniazide chez les hommes. Nous pouvons émettre cette hypothèse que les hommes sont plus exposés dans leur rôle sociétal en rapport avec leurs activités. Ce qui faciliterait la transmission du bacille et les risques de résistance. Comparativement à d'autres travaux, ce constat a été également démontré dans les travaux sur la résistance aux antituberculeux menés par SANGARE L. et al (2010) sur la résistance aux antituberculeux chez les cas de tuberculose pulmonaire nouveaux ou traités antérieurement au Burkina-Faso. D'autres études en Afrique ont également démontré que le genre masculin présente plus de résistance que le genre féminin (Kouassi B. et al, 1998). Dans nos collectes de données, les tranches d'âge 15 ans ou moins et au-delà de 65 ans ne présentent presque pas de résistance à la rifampicine, ni de MDR. La résistance à la rifampicine est plus élevée dans les tranches d'âge de 24-34 ans et de 35-44 ans contrairement aux autres tranches qui présentent moins de résistance ou presque pas à la rifampicine. Ces tranches d'âge présentent également une multirésistance plus élevée que les autres tranches Présenté par TOGDE Gildas le Djimbaye Page 39 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
RISQUE DE TUBERCULOSE d'âge. Les jeunes sont affectés dans beaucoup de secteurs d'activités de la société et les voyages, ce qui rendrait leur exposition au risque de tuberculose (Kouassi B. et al, 1998). Dans les cas d'échec, 17,65% des cas ont été résistants à la rifampicine et 17,39% ont été MDR. Le taux de 13% de MDR rapporté par l'OMS dans les cas d'échec au traitement (WHO, 2009) est très inférieur à celui de notre étude, il peut provenir de pratiques de routine et non d'une étude (SANGARE L. et al. 2010). Lorsque nous appliquons les recommandations de l'OMS, les malades en contrôle positifs au 3èm mois de traitement de 1ère ligne (M3+) et en cas de rechute présentent les taux élevés de multirésistance avec respectivement 5,79% et 5,07%. Dans notre étude, les hommes sont plus nombreux dans les cas d'échec, de rechute et M3+. La région du centre présente les taux de résistance à la rifampicine et de MDR plus élevé que les autres régions, celle des hauts bassins présente également un taux de MDR élevé. D'après le recensement du Burkina-Faso en 2010, ces deux régions sont les plus peuplés avec respectivement 12,3% et 10,5% de la population (insd, 2008). Ces deux régions représentent un carrefour avec plusieurs peuples de l'intérieur comme de l'extérieur du pays. La densité populaire et le fait que dans ces deux grandes régions se trouvent les grandes structures de santé où sont acheminés la plupart de prélèvement, pourraient expliquer ces taux élevés. Une étude similaire de résistance aux antituberculeux a été réalisée dans la région des hauts bassins par LOMPO Amelie (2012) avait donné 5,9% de MDR. Les difficultés majeures rencontrées au cours de l'étude étaient les problèmes liés aux réactifs. Ceci a contribué au prolongement de notre stage initialement prévu pour 06 mois à 12 mois. Nous étions conformés au programme de biologie moléculaire du laboratoire. Outre ces difficultés rencontrées, nous avons bénéficiés d'un bon encadrement du personnel de CNLAT et d'un environnement accueillant. En perspectives, nous nous proposons de poursuivre avec l'étude des mycobactéries par la caractérisation génétique, biochimique et structurale de leur ATP synthase qui pourrait être une cible de traitement. DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DU CMTB CHEZ LES PATIENTS A
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