II.2.4.2 Sacrifie, préparation du sérum
et des homogénats des organes
Au terme de 28 jours d'expérimental, les rats ont
été sacrifiés. Le sang a été
prélevé dans deux séries de tubes. La première
série était constituée des tubes secs. Ils ont
été laissés au repos pendant 4 heures à
température ambiante puis centrifugés pendant 15 min à
3000 trs/min. Le sérum (surnageant) a été collecté,
aliquoté puis conservé dans des tubes eppendorf à
-20°C pour les dosages des paramètres biochimiques. La
deuxième série était constituée des tubes
héparinés. Le sang entier contenu dans la deuxième
série de tubes a immédiatement servi au dosage des
paramètres hématologiques. Les organes tels que le poumon, le
foie et les testicules ont été également
prélevés puis broyés dans un mortier, pour cela 1 mL de
broyat a été homogénéisé dans 9 mL de tampon
phosphate 0,1 M, pH 7,4 et en suite centrifugé à 3000trs/min
pendant 10 min à 25°C a servi le dosage des malondialdéhyde.
Une partie de ces organes a été également nettoyés
avec de l'eau physiologique, puis pesés. Ces organes ont
été fixés par le formol à 50 % contenue dans un
bocal en verre pour les réalisations ultérieures des coupes
histologiques. Les masses des différents organes et de chaque rat ont
été notées pour la détermination des indices
d'organe.
IO =
masse d'organe
L'indice d'organe est un paramètre qui permet de
connaitre l'influence de la prise alimentaire et le traitement sur
l'état des organes après l'expérience. L'apparition des
inflammations au niveau de ceux-ci ou d'atrophie renseigne sur la
toxicité de l'alimentation ainsi que le traitement. Elle est
déterminée selon la formule suivante :
× 100
poids de l'animal après sacrifice
II.2.4.3 Dosage des paramètres biochimiques a)
Dosage du cholestérol total
Le cholestérol total a été dosé
par la méthode enzymatique décrite par Naïto (1984) à
l'aide des kits Monlab Test.
? Principe
Sous l'action du cholestérol estérase, le
cholestérol estérifié est transformé en
cholestérol et acide gras. L'oxydation du cholestérol en
présence du cholestérol oxydase produit le
cholestérol-3-one et du peroxyde d'hydrogène. La
quinonéimine (rose) sert d'indication qui se forme par action du
peroxyde d'hydrogène, du 4-aminoantipyrine et du phénol sous
l'action
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catalytique de la peroxydase. L'absorbance du complexe
coloré proportionnelle à la concentration en cholestérol
d'un échantillon est mesurée à 500nm.
Ester du cholestérol + H2O cholestérol
estérase cholestérol + acide gras
Cholestérol + O2 cholestérol oxydase
cholestérol-3-one + H2O
2H2O2 + phénol + 4- aminoantipyrine peroxydase
quinonéimine + 4H2O
? Mode opératoire
1000 uL de la solution d'enzyme a été introduit
dans le tube. Puis 10 uL de plasma suivie de 10ul ont été
introduit respectivement de solution standard. Après
homogénéisation l'ensemble a été incubé
à la température ambiante pendant 10min. L'absorbance a
été lue à 505nm contre le blanc de l'eau à la place
d'échantillon.
b) Dosage du cholestérol HDL
Le cholestérol HDL est dosé par la
méthode enzymatique décrite par Rifai et al. (1999)
à l'aide des kits INMESCO.
? Principe
Les lipoprotéines (chylomicrons, VLDL et LDL) sont
précipitées par l'ajout de l'acide phosphotungstique et du
chlorure de magnésium. Après centrifugation, le surnageant clair
contenant la fraction de HDL, qui est testée avec le réactif du
kit Chromolab pour la détermination du taux de HDL
cholestérol.
? Mode opératoire
Dans un tube à centrifuger sont introduits 500 uL de
plasma et 1000 uL de réactif ont été introduit
respectivement. Après homogénéisation, le tube a
été laissé au repos pendant 10 minutes à la
température ambiante, puis centrifugé à 4000 trs/min
pendant 10 min et le surnageant a été recueilli et 1000 uL de
réactif du dosage du cholestérol total a été
introduit. Dans les tubes de dosage et d'étalon ont été
ajoutés 100 uL de plasma et 10 uL de solution standard, respectivement.
Après homogénéisation et incubation pendant 10min, la
lecture de la densité optique a été lue à 500 nm
contre le blanc.
c) Détermination du taux de
Triglycérides
Les triglycérides ont été dosés
selon la méthode enzymatique décrite par Kaplan et al.
(1984) à l'aide des kits Monlab Test.
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? Principe
Sous l'action de lipases, les triglycérides (TG) est
hydrolysés en glycérol et en acide gras. Le glycérol est
ensuite transformé en peroxyde d'hydrogène sous l'action
successive du glycérol-kinase et de la glycérol-3-phosphate
oxydase. La quinonéimine sert d'indicateur qui se forme de peroxyde
d'hydrogène, 5-aminoantipyrine et 4-chlorophénol sous l'action
catalytique de la peroxydase.
Triglycérides + H2O lipase Glycérol + acide gras
Glycérol + ATP Glycerol kinase Glycérol-3-
phosphate +ADP
Glycérol-3-phosphate + O2 Glycerol -3- phosphore
oxidase Dihydroxacétone phosphore + H2O2 2H2O2 + 4-aminoantipyrine +
4-chlorophénol peroxydase quinonéimine + 4H2O
L'absorbance du complexe coloré (quinonéimine)
proportionnelle à la concentration en triglycéride dans
l'échantillon a été mesuré à 500nm.
? Mode opératoire
Dans les tubes de dosage, d'étalon et de blanc ont
été introduit dans 1000 uL de solution enzymatique. Dans les
tubes de dosage et d'étalon ont été ajoutés
respectivement 10 uL de plasma et 10 uL de solution standard. Après
homogénéisation et incubation pendant 15 min, la lecture de la
densité optique est faite à 505 nm contre le blanc entre 15
à 25°C.
d) Détermination du cholestérol
LDL
La concentration du cholestérol LDL est calculée
à partir de la concentration du cholestérol total, de la
concentration du cholestérol HDL et de la concentration de
triglycérides selon la formule de Friedewald et al. (1972)
suivante :
Cholestérol LDL = cholestérol total -
cholestérol HDL
(??g/d??)
5
T??ig??y??é??id??
e) Dosage de la malondiadéhyde
Il a été fait selon la méthode
décrite par Yagi (1976).
? Principe
Les composés carbonylés à l'instar du
malondialdéhyde (MDA) réagissent avec l'acide thiobarbiturique
(TBA) pour donner des chromophores de couleur rose absorbant à une
longueur d'onde de 532 nm.
? Mode opératoire
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100 ìL d'échantillon et 400 ìL de
réactif TBA ont été introduit dans des tubes à
essai en
verre, puis fermés hermétiquement. Le
mélange a été chauffé au bain marie à
100°C pendant 15 min ; puis refroidi dans un bain d'eau froide pendant 30
min. Les tubes ont été ouverts pour permettre l'évacuation
des gaz formés lors de la réaction. Le mélange a
été ensuite centrifugé à 3000 tours/min pendant 5
min à 25 °C. L'absorbance a été lue à 532
nm.
Expression des résultats
La concentration du MDA a été
déterminée en utilisant son coefficient d'extinction
moléculaire (å = 1,53*105 M-1 cm-1) selon la
formule suivante :
DO= å. L. C C = DO / ?. L
C : Concentration de MDA en mmol ;
DO : Densité optique lue à 530nm ;
E : Coefficient d'extinction molaire du MDA,
E MDA = 1,53 ×10-5
M-1cm-1
L : Longueur du trajet optique = 1cm
La concentration de MDA a été exprimé en uM
/mg de protéines.
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