CHAPITRE I I : M A T É RIE L E T M É T H
ODES
2 8
CHAPITRE I I : M A T É R I E L E T M É T H
O D E S
I I .1 . C A D R E DE L'ÉTUDE
Nous avons effectué une étude
expérimentale a u sein d u Laboratoire d e Biochimie d e l a
Faculté d e M é d e c i n e e t d e s Sciences
Biomédicales d e l'Université d e Yaoundé 1 .
I I .1 .1 . Considération
éthique
Dans l e souci d e garantir notre propre
sécurité e t surtout celle des patients, nous avons obtention une
clairance d e référence N ° 6 7 6 / C R E R S H / 2 0 1 9 (
annexe VII) délivrée par l e Comité Régional d ' E
t h i q u e d e l a Recherche pour l a Santé Hum aine d u C entre ( C R
E R S H / C ) . Après obtention d e cette clairance i l s'agissait alors
d e collecter les échantillons d e sang chez les sujets d r é p a
n o c y t a i r e s , h o m mes e t femmes, consentants, informés e t
venus e n consultation d e routine a u service d ' H é m a t o l o g i e
d e l ' H ô p i t a l C e n t r a l e d e Yaoundé.
I I .1 .2 . Critères d e collecte des
échantillons
Pour participer à cette étude, i l fallait
être d r é p a n o c y t a i r e homozygote S S , âgé
d'au moins 1 0 ans e t suivi a u service d ' H é m a t o - O n c o l o g
i e d e l'Hôpital Central d e Yaoundé. Exception faite des
patients e n état d e crise, e t ceux ayant été
transfusé pendant les trois ( 0 3 ) derniers m ois
précédent l'étude.
I I .2 . M A T É R I E L
I I .2 .1 . M a t é r i e l
végétal
L e matériel végétal était
constitué d e l a Spiruline récoltée à l a ferme d
e production située à Nom a y o s ( Yaoundé-Cameroun). Ce
matériel séché à l'étuve ( 3 7 - 4 5 °
C ) , a ensuite été acheminé à l ' H e r b i e r N
a t i o n a l d u Cam e r o u n pour authentification.
a ) Spiruline à l'état frais b ) Spiruline
à l'état sec
2 9
Figure 6 : Photographie d e l a spiruline
à l ' é t a t frais e t sec.
I I .2 .2 . M atériel biologique
Les échantillons d e sang ont été
prélevés chez les patients drépanocytaires hom ozygotes S
S confirmés venus e n consultation d e routine a u service d ' H
é m a t o - O n c o l o g i e d e l ' H ô p i ta l Central d e Y
aoundé.
I I .3 . M É T H O DES
I I .3 .1 . Extraction aqueuse
À l ' a i d e d ' u n e balance électrique ( d
e m arque M e t t l e r T o l e d o e l 6 0 2 ) 5 0 g d e poudre d e Spiruline
ont été pesés puis introduit dans 1 0 0 0 m L d ' e a u
distillée. L e mélange obtenu a été hom
ogénéisé pendant 1 heure à l ' a i d e d ' u n
agitateur magnétique. Puis, laissé à température
ambiante e t filtré après 2 4 h à l ' a i d e d ' u n
papier filtre w a t t m a n 4 . Les résidus ont été
à nouveau trempés dans u n volume d ' e a u distillée d e
1 0 0 0 m L pendant 2 4 h puis filtré. L e filtrat obtenu a
été lyophilisé. L e r e n d e m ent d e l ' e x t r a c t
i o n a été calculé selon l a f o r m ule
ci-après:
m asse de l' extrait brut obtenu
m asse de poudre initiale
L e lyophilisat a ensuite été conservé
à l ' a b r i d e l a l u m ière pour l a suite des tests.
I I .3 .2 . Collecte des échantillons d e sang
chez les sujets drépanocytaires
? Procédure d e collecte
Quatre millilitres e t demi d e sang ont été
prélevés dans les tubes éthylène d i a m i n e
tétraacétique ( E D T A ) a u niveau d u pli d u coude par u n
personnel médical qualifié e t les échantillons ont
été acheminés a u Laboratoire d e Biochimie d e l a
Faculté d e M édecine e t des Sciences B i o m é d i c a l
e s d e l ' U n i v e r s i t é d e Y a o u n d é 1 pour les
tests d e falciform a t io n e t les tests a n t i h é m o l y t i q u e
s .
I I .3 .3 . Évaluation i n vitro des
propriétés antifalcém iantes d e l ' e x t r a i t aqueux
d e Spirulina platensis.
I I .3 .3 .1 . Induction i n vitro d e l a
falciform ation.
? Principe
L ' h y p o x i e induite par l e m étabisulfite d e
sodium à 2 % ( M B S ) transform e les h é m aties
norm ales e n drépanocytes (Joppa e t a l .,
2 0 0 8 ) .
3 0
? M ode opératoire
Cent m i c r o l i t r e s d e sang ont été
introduits dans u n tube à e p p e n d o f f puis, 1 0 0 u L d e
solution d e m é t a b i s u l f i te d e sodium ( 2 % ) ont
été ajoutés, l e mélange a été
homogénéisé puis incubé à température
a m b i a n t e . 1 0 u L d e c e mélange ont été
dilués dans 1 9 9 0 u L d u liquide d e
M a r c i a n o , e t 2 0 u L ont été
déposés sur l a cellule d e M a l a s s e z à l'aide d e l
a m i c r o p i p e t t e e t recouverte d'une l a m e l l e p u i s
observé a u m i c r o s c o p e . L e s h é m a t i e s t o t a l
e s e t d e s d r é p a n o c y t e s ont été c o m p t
é s a u microscope optique à objectif 4 0 dans 4 zones unitaires
quadrillées choisie a u hasard dans les 2 5 carrés moyens d e l a
cellule après 3 0 m i n , 1 h , 1 h 3 0 m i n , 2 h , 2 h 3 0 min e t
3 h . L e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n initial
a été obtenu par c o m p t a g e des h é m a t i e s
totales e t des d r é p a n o c y t e s d e chaque échantillon e
n rem plaçant l e m é t a b i s u l f i t e d e sodium par l e N
a C l 0 ,9 % e t traités dans les m ê m e s conditions.
L e pourcentage d e f a l c i f o r m a ti o n a
été calculé d'après l a form u l e :
n
F( % ) = X ??00
N ??
n = nombre d e d r é p a n o c y t e s ; N t = nombre t o
t a l d e s h é m a t i e s d é n o m b r é e s (
J o p p a e t a l ., 2 0 0 8 ) .
I I .3 .3 .2 . Évaluation d e l'activité i
n h i b i t r i c e d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n
s i s sur
l a f a l c i f o r m a t i o n .
L e s extraits d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s
( préparés dans l e N a C l 0 ,9 % ) ont été
utilisés pour l'évaluation d e l'activité inhibitrice de
la f a l c i f o r m a t io n e n présence d u sang e t d u M B S 2 %
.
? Principe
L ' hypoxie induite par l e m é t a b i s u l f i t e
d e sodium à 2 % ( M B S ) transform e les h é m a t ie s norm
ales e n d r é p a n o c y t e s ( J o p p a e t a l .,
2 0 0 8 ) .
? M ode opératoire
Dans cinq tubes à e p p e n d o f f contenant 1 0 0 u L d
e chaque solution d'extrait aux
c o n c e n t r a t i o n s d e 1 0 0 , 2 0 0 , 4 0 0 , 8 0 0 e
t 1 6 0 0 u g / m L , o n t é t é a j o u t é s 5 0 u L d
e sang S S e t 5 0 u L
d e solution d e m é t a b i s u l f i te d e sodium (
2 % ) . L e s tubes ont été incubés à
température ambiante pendant 2 h 3 0 m i n ( l e temps maximum d e l a f
a l c i f o r m a t io n obtenu a u cours d e l ' i n d u c t i o n ) . L e s
hématies totales e t les d r é p a n o c y t e s sont
comptés a u microscope optique à l'aide d e l a cellule d e M a l
a s s e z . L a phénylalanine a été utilisée comme
c o n t r ô l e p o s i t i f a u x mêmes concentrations que les e
x t r a i t s . P o u r a p p r é c i e r l ' a c t i v i t é
inhibitrice d e chaque e x t r a i t , l e taux d'inhibition a
été calculé par l a formule :
3 1
( % ) /N H = f0 - fn x 100
f0
O ù f 0 : est l e pourcentage d e falciform a t io n
maxim a l e n présence d e sang HbS + M BS 2 %
f n : l e pourcentage d e falciform a ti o n minim a l e n
présence d e sang HbS + M B S 2 % + extrait
(Joppa e t a l ., 2 0 0 8 )
I I .3 .3 .3 . Évaluation d e l ' e f f e t
des extraits d e Spirulina platensis sur l a
réversibilité d e l a falciform ation.
· Principe :
L a réversibilité d e l a falciform a t i o n d
e basée sur l a réduction d u pourcentage d e falciform a t io n
initiale après incubation d u sang avec l ' e x t r a i t .
· M ode opératoire :
L ' e f f e t d e l ' e x t r a i t sur l a
réversibilité d e l a falciform a t i o n a été
réalisé e n incubant 5 0 u L d e sang à température
ambiante avec 5 0 u L d e l ' e x t r a i t aux différentes
concentrations pendant 2 h , 4 h , 2 4 h . L e pourcentage d e falciform a t i
o n a été calculé avant e t après les incubations.
L e pourcentage d e falciform a t i o n est alors d é t e r m i n
é d e l a même façon que précédemment. Les
pourcentages obtenus nous ont p e r m i s d e calculer les différents
taux d e réversibilité d e l a falciform ation ( % R ) selon l a
form ule suivante :
( % ) R = f0- fn x 100
f0
F 0 : est l e pourcentage d e falciform ation initiale e t F n
l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n minim ale obtenue e n
présence d ' e x t r a i t o u d e phénylalanine (Joppa e
t a l ., 2 0 0 8 ) .
Les concentrations ayant montrés des meilleurs
activités antifalcém iantes ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) ont
été utilisées pour évaluer i n vitro l ' a
c t i v é antihém olytique d e l ' e x t r a i t aqueux d e
spiruline.
I I .3 .4 . Évaluation i n vitro d e l
' a c t i v i t é antihém olytique d e l ' e x t r a i t aqueux d
e Spirulina
platensis
L ' e f f e t antihém olytique d e l ' e x t r a i t d
e plante est évalué i n vitro sur les
érythrocytaire. C e dernier est facile à isoler d u sang e t s a
membrane présente des sim ilitudes avec d'autres membranes cellulaires (
S h o b a n a e t V i d h y a , 2 0 1 6 ) .
3 2
I I .3 .4 .1 . Préparation d e l a suspension
é r y t h r o c y t a i r e
L e sang utilisé p o u r p r é p a r e r l e s
suspensions é r y t h r o c y t a i re s a été
prélevé dans des tubes E D T A chez des patients d r é p a
n o c y t a i r e s homozygotes S S . Après centrifugation à 3 0
0 0 t rs p e n d a n t 5 m i n , l e c u l o t r é c u p é r
é e s t l a v é 3 fois avec l a solution PBS i s o - s a l i n e
f o r m é e d e tampon phosphate d e potassium 1 0 m M , p H = 7 ,4 e t
1 5 4 m M d e N a C l . Chaque lavage consistait e n une suspension des
cellules dans d u PBS I s o salin e t une centrifugation à 3 0 0 0 t r s
pendant 5 m i n . Après l a dernière centrifugation, l e culot
est r e s u s p e n d u à nouveau dans une solution d u PBS i s o - s a
l i n à raison d e 1 volume d u culot e t 9 volumes d u PBS, permettant
ainsi d'obtenir u n h é m a t o c r i t e à 1 0 % ( Rani
e t a l . , 2 0 1 4 ) .
I I .3 .4 .2 . M i s e a u point des tests d e l ' h
é m o l y s e induite i n vitro par différents
inducteurs
Pour tester l'effet a n t i h é m o l y t i q u e d e
notre extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s , les
deux concentrations 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ayant montré des
meilleures activités a n t i f a l c é m i a n te s ont
été utilisées. A u préalable, des tests
sur modèle é r y t h r o c y t a i r e d e l ' h é m o l y
s e induite par différents agents « milieu hypotonique, acide
salicylique, triton X - 1 0 0 e t l ' H 2 O 2 ) ont
été faits e n absence d e l'extrait afin d e d é t e r m i
n e r l a concentration qui induit une h é m o l y s e maximale.
? Principe :
L ' e x p o s i t i o n des globules rouges ( R B C ) à
certains conditions p h y s i c o chimiques tels que l e milieu h y p o t o n i
q u e , l ' u t i l i s a ti o n d'un p e r t u r b a t e u r m e m b r a n a i
r e comme les détergents o u les espèces réactifs
oxygénées ( R O S ) , provoque une rupture d e s a membrane
cytoplasm i q u e provoquant ainsi l a libération d e l ' h é m o
g l o b i n e qui sera alors dosée par spectrophotométrie d ' a b
s o r b a n c e visible à 5 4 0 n m .
? Induction par l'aspirine
? M ode opératoire
À 4 . 5 m L d e N a C l hypotonique ( 4 ,5 m g / m L )
, ont été ajouté 5 0 ì L d e l'aspirine d e
concentrations variant entre 0 e t 0 , 7 m g / m L préparées
à partir d e comprimés d'aspirine d e 1 0 0 0 m g . L e tube t
é m o i n reçoit l e m ê m e v o l u m e d u tampon
phosphate i s o - salin ( P B S ) , puis une quantité d e 5 0 0 ì
L d e l a suspension é r y t h r o c y t a i r e est ajoutée dans
chaque tube. Ces tubes sont ensuite homogénéisés e t
incubés à 3 7 ? C pendant 3 0 min dans u n bain marie. Les tubes
sont centrifugés ( 3 0 0 0 t r s ; 5 m i n ) e t l ' a b s o r b a n c e
d e s u r n a g e a n t e s t m e s u r é e à 5 4 0 n m (
H o u c h e r e t a l ., 2 0 0 1 ) .
? Induction hypotonique
? M ode opératoire :
Afin d e déterminer l a concentration d u N a C l qui
provoque l a lyse des globules rouges, o n a additionné 1 0 0 u L d e l
a suspension érythrocytaire ( 1 0 % ) à 5 m L d e N a C l
à différentes concentrations ( 3 ,5 - 8 ,5 m g / m L ) , ainsi q
u ' u n témoin négatif ( N a C l isotonique 9 m g / m L ) e t u n
témoin positif ( l ' e a u distillée). Après incubation
pendant 3 0 m i n à température ambiante, l e mélange a
été centrifugé 1 0 m i n à une vitesse d e 3 0 0 0
t r s , à l a fin o n a effectué une lecture des densités
optiques à 5 4 0 n m ( L o u e r r a d e t a l ., 2 0 1
6 ) .
? Induction par l e triton X - 1 0 0
? M ode opératoire :
Huit cent m icrolitres d u triton-100 à
différentes concentrations ( 0 ,0 0 1 % , 0 ,0 3 % , 0 ,0 4 % , 0 ,0 5 %
, 0 ,1 % , 1 % ) ont été m élangés avec 2 ,2 m L d
u tampon phosphate ( 0 ,2 M , p H = 7 ,4 contenant 0 ,9 % d e N a C l ) e t 5 0
0 u L d e l a suspension érythrocytaire ( 1 0 % ) . L e m élange
a été incubé 1 h , à 3 7 ° C , puis
centrifugé à 3 0 0 0 r p m pendant 5 m i n . L a densité
optique d u surnageant a été mesurée à 5 4 0 n m ,
o n a préparé d e même façon l e contrôle m
ais e n absence d u triton - 1 0 0 ( M uthu e t D u r a i r a , 2 0 1 5
) .
? Induction par l e peroxyde d ' h y d r o g è n
e H 2 O 2
? M ode opératoire :
5 0 0 u L d e H 2 O 2 à
différentes concentrations initiales ( 9 % ; 6 % ; 3 % ; 1 % ; 0 ,5 % ;
0 ,3 % ; 0 ,2 % ) ont été m élangés avec u n volume
d e 2 5 0 u L d e l a suspension d e globules rouges, après une
durée d e 3 h d ' i n c u b a t i o n à 3 7 ° C , o n a
ajusté par l e PBS j u s q u ' à 4 ,5 0 0 m L puis l e m
élange a été soumis à une centrifugation pendant 1
0 min avec une vitesse d e 3 0 0 0 t r s . L ' a b s o r b a n c e des
surnageants a été lue à 5 4 0 n m . Les
contrôles ont été préparés e n rem
plaçant l ' H 2 O 2 par l ' e a u distillée
pour l e contrôle positif e t par l a solution PBS pour l e
contrôle négatif (Jam e s e t A l e w o , 2 0 1 4 )
.
? Calcule des taux d ' h é m olyse
L e pourcentage d ' h é m o l y s e pour tous les
tests a été calculé e n appliquant l a formule suivante
(Shobana e t Vidhya, 2 0 1 6 ) :
% d' hé m olyse
=
|
Ales du test
|
x 100 Avec Abs = Absorbance
|
|
|
3 3
Ales du contrôle
I I .3 .4 .3 . M esure d e l ' e f f e t a n t i h
é m olytique d e l ' e x t r a i t s d e S p i r u l i n a p l a t e
n s i s sur chaque
inducteur
L e taux d ' i n h i b i t i o n d ' h é m o l y s e
pour tous les tests a été calculé e n appliquant l a f o r
m u le
suivante ( S hob a n a e t V i d h y a , 2 0 1 6
) :
% d 'inhibition d'
|
hém olyse =
|
Abs du contrô le- Abs du test
|
x 100 Avec Abs = Absorbance
|
|
|
3 4
Abs du contrôle
? Effet d e l ' e x t r a i t sur l ' h é m olyse
induite par l ' a s p i r i n e
Cinq cent m icrolitres d e l ' e x t r a i t à
différentes concentrations ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) ont
été additionné à 2 5 0 ì L d e l a
suspension érythrocytaire e t incubé 5 m i n , p u i s 2 5
ì L d e l ' a s p i r in e à une concentration d e 0 , 7 m g / m
L ont été ajoutés avec 1 7 5 0 u L d u N a C l hypotonique
( 0 , 4 5 % ),
l e mélangea été
homogénéisé e t incubé pendant 1 h à 3 7 ? C
puis centrifugé à 3 0 0 0 t r s pendant 5
m i n , les densités optiques des surnageants ont
été lues à 5 4 0 n m . U n contrôle e n absence d
e
l ' e x t r a i t dans les m ê m e s conditions e n
remplaçant l e volume d e l ' e x t r a i t par l e N a C l 0 ,4 5 % e t
u n standard (quercétine) ont été
réalisé ( H oucher e t a l ., 2 0 0 1 )
.
? Effet d e l ' e x t r a i t sur l ' h é m olyse
induite par l a solution hypotonique ( N a C l )
Cinquante m icrolitres d e l ' e x t r a it à
différentes concentrations ( 8 0 0 - 1 6 0 0 u g /m L ) , ont
été
m é l a n g é s avec 5 0 ì L d e l a
suspension érythrocytaire, après une incubation d e 1 0 m i n
à température ambiante, 2 , 5 m L d u N a C l à une
concentration d e 0 , 3 5 % ont été ajoutés. L e
mélange est laissé incubé à 3 7 ° C pendant 3
0 min puis centrifugé à 3 0 0 0 t r s p e n d a n t 1 0 min. L '
a b s o r b a n c e d u surnageant a été lue à 5 4 0 n m ,
d e même U n contrôle e n absence d ' e x t r a it
rem placé par l e même volume d e N a C l 0 , 3
5 % e t u n standard (quercétine) ont été
réalisé
(Louerrad e t a l ., 2 0 1 6 )
.
? Effet d e l ' e x t r a i t sur l ' h é m olyse
induite par l e triton X - 1 0 0
U n volume d e 5 0 0 u L d ' e x t r a i t s à
différentes concentrations ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) a
été ajouté à 2 5 0 ì L d e l a suspension
érythrocytaire, l e m élange a été incubé
pendant 5 min à une température ambiante, puis additionné
4 0 0 ì L d u détergent triton X - 1 0 0 à 1 % ;
après une incubation d ' u n e heure à 3 7 ° C suivie d ' u
n e centrifugation à 3 0 0 0 t r s pendant 1 0 m i n , une lecture des D
O à 5 4 0 n m a été réalisée. L e
contrôle préparé e n absence d e l ' e x t r a i t rem
placé par l e même volume e n tampon phosphate isosalin e t u n
standard (quercétine) ont été réalisé
( M uthu e t D u r a i r a , 2 0 1 5 ) .
3 5
? Effet d e l'extrait d e S p i r u l i n a p l a t e n s
i s sur l ' h é m o l y s e induite par l ' H 2 O
2
Deux cent cinquante m i c r o l i t r e s d e l a suspension
é r y t h r o c y t a i r e e t 5 0 0 ì L d'extrait à
différentes concentrations ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) ont
été incubés pendant 3 0 min à température
ambiante puis o n a ajouté 5 0 0 ì L d e H 2 O
2 ( 9 % ) , e t après une incubation pendant 3 h à 3 7
° C , o n a ajusté l e volume f i n a l à 4 5 0 0 ì L
par le PBS, à l a fin une centrifugation à 3 0 0 0 t r s pendant
1 0 min e t une lecture des D O à 5 4 0 n m e t d e même
façon o n a réalisé l e test standard e n utilisant l a q
u e r c é t i n e comme molécule d e r é f é r e n
c e . L e contrôle a été réalisé e n absence
d'extrait e t e n présence d e l'eau distillée. ( Jam e s
e t A l e w o , 2 0 1 4 ) .
I I .4 . A N A L Y S E S STATISTIQUES E T EXPRESSION DES
RÉSULTATS
Pour chaque activité ci-dessus , les tests ont
été effectués par groupe d e q u a d r u p l e t s , l e s
résultats classés sous form e d e moyen #177; écart type
standard, les calculs, les courbes e t diagrammes étaient faits à
l'aide d u logiciel Excel 2 0 1 3 e t les données ont été
analysées e n utilisant l'analyse d e variance à u n facteur (
One Way ANOVA) suivi d u test Post-hot d e D u n n e t t pour les c o m
paraisons multiples.
| 
