WOW !! MUCH LOVE ! SO WORLD PEACE !
Fond bitcoin pour l'amélioration du site: 1memzGeKS7CB3ECNkzSn2qHwxU6NZoJ8o
  Dogecoin (tips/pourboires): DCLoo9Dd4qECqpMLurdgGnaoqbftj16Nvp


Home | Publier un mémoire | Une page au hasard

 > 

Evaluation in vitro des propriétés antifalcémiantes et antihémolytiques de l'extrait aqueux de spirulina platensis (oscillatoriaceae) du Cameroun


par Apollinaire TEGUEM TCHOULEGHEU
Université Yaoundé 1 - Master 2 2019
  

précédent sommaire suivant

Bitcoin is a swarm of cyber hornets serving the goddess of wisdom, feeding on the fire of truth, exponentially growing ever smarter, faster, and stronger behind a wall of encrypted energy

CHAPITRE I I : M A T É RIE L E T M É T H ODES

2 8

CHAPITRE I I : M A T É R I E L E T M É T H O D E S

I I .1 . C A D R E DE L'ÉTUDE

Nous avons effectué une étude expérimentale a u sein d u Laboratoire d e Biochimie d e l a Faculté d e M é d e c i n e e t d e s Sciences Biomédicales d e l'Université d e Yaoundé 1 .

I I .1 .1 . Considération éthique

Dans l e souci d e garantir notre propre sécurité e t surtout celle des patients, nous avons obtention une clairance d e référence N ° 6 7 6 / C R E R S H / 2 0 1 9 ( annexe VII) délivrée par l e Comité Régional d ' E t h i q u e d e l a Recherche pour l a Santé Hum aine d u C entre ( C R E R S H / C ) . Après obtention d e cette clairance i l s'agissait alors d e collecter les échantillons d e sang chez les sujets d r é p a n o c y t a i r e s , h o m mes e t femmes, consentants, informés e t venus e n consultation d e routine a u service d ' H é m a t o l o g i e d e l ' H ô p i t a l C e n t r a l e d e Yaoundé.

I I .1 .2 . Critères d e collecte des échantillons

Pour participer à cette étude, i l fallait être d r é p a n o c y t a i r e homozygote S S , âgé d'au moins 1 0 ans e t suivi a u service d ' H é m a t o - O n c o l o g i e d e l'Hôpital Central d e Yaoundé. Exception faite des patients e n état d e crise, e t ceux ayant été transfusé pendant les trois ( 0 3 ) derniers m ois précédent l'étude.

I I .2 . M A T É R I E L

I I .2 .1 . M a t é r i e l végétal

L e matériel végétal était constitué d e l a Spiruline récoltée à l a ferme d e production située à Nom a y o s ( Yaoundé-Cameroun). Ce matériel séché à l'étuve ( 3 7 - 4 5 ° C ) , a ensuite été acheminé à l ' H e r b i e r N a t i o n a l d u Cam e r o u n pour authentification.

a ) Spiruline à l'état frais b ) Spiruline à l'état sec

2 9

Figure 6 : Photographie d e l a spiruline à l ' é t a t frais e t sec.

I I .2 .2 . M atériel biologique

Les échantillons d e sang ont été prélevés chez les patients drépanocytaires hom ozygotes S S confirmés venus e n consultation d e routine a u service d ' H é m a t o - O n c o l o g i e d e l ' H ô p i ta l Central d e Y aoundé.

I I .3 . M É T H O DES

I I .3 .1 . Extraction aqueuse

À l ' a i d e d ' u n e balance électrique ( d e m arque M e t t l e r T o l e d o e l 6 0 2 ) 5 0 g d e poudre d e Spiruline ont été pesés puis introduit dans 1 0 0 0 m L d ' e a u distillée. L e mélange obtenu a été hom ogénéisé pendant 1 heure à l ' a i d e d ' u n agitateur magnétique. Puis, laissé à température ambiante e t filtré après 2 4 h à l ' a i d e d ' u n papier filtre w a t t m a n 4 . Les résidus ont été à nouveau trempés dans u n volume d ' e a u distillée d e 1 0 0 0 m L pendant 2 4 h puis filtré. L e filtrat obtenu a été lyophilisé. L e r e n d e m ent d e l ' e x t r a c t i o n a été calculé selon l a f o r m ule ci-après:

m asse de l' extrait brut obtenu

Rendem ent ( % ) _

 

X 100

 
 

m asse de poudre initiale

L e lyophilisat a ensuite été conservé à l ' a b r i d e l a l u m ière pour l a suite des tests.

I I .3 .2 . Collecte des échantillons d e sang chez les sujets drépanocytaires

? Procédure d e collecte

Quatre millilitres e t demi d e sang ont été prélevés dans les tubes éthylène d i a m i n e tétraacétique ( E D T A ) a u niveau d u pli d u coude par u n personnel médical qualifié e t les échantillons ont été acheminés a u Laboratoire d e Biochimie d e l a Faculté d e M édecine e t des Sciences B i o m é d i c a l e s d e l ' U n i v e r s i t é d e Y a o u n d é 1 pour les tests d e falciform a t io n e t les tests a n t i h é m o l y t i q u e s .

I I .3 .3 . Évaluation i n vitro des propriétés antifalcém iantes d e l ' e x t r a i t aqueux d e Spirulina platensis.

I I .3 .3 .1 . Induction i n vitro d e l a falciform ation.

? Principe

L ' h y p o x i e induite par l e m étabisulfite d e sodium à 2 % ( M B S ) transform e les h é m aties

norm ales e n drépanocytes (Joppa e t a l ., 2 0 0 8 ) .

3 0

? M ode opératoire

Cent m i c r o l i t r e s d e sang ont été introduits dans u n tube à e p p e n d o f f puis, 1 0 0 u L d e solution d e m é t a b i s u l f i te d e sodium ( 2 % ) ont été ajoutés, l e mélange a été homogénéisé puis incubé à température a m b i a n t e . 1 0 u L d e c e mélange ont été dilués dans 1 9 9 0 u L d u liquide d e

M a r c i a n o , e t 2 0 u L ont été déposés sur l a cellule d e M a l a s s e z à l'aide d e l a m i c r o p i p e t t e e t recouverte d'une l a m e l l e p u i s observé a u m i c r o s c o p e . L e s h é m a t i e s t o t a l e s e t d e s d r é p a n o c y t e s ont été c o m p t é s a u microscope optique à objectif 4 0 dans 4 zones unitaires quadrillées choisie a u hasard dans les 2 5 carrés moyens d e l a cellule après 3 0 m i n , 1 h , 1 h 3 0 m i n , 2 h , 2 h 3 0 min e t

3 h . L e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n initial a été obtenu par c o m p t a g e des h é m a t i e s totales e t des d r é p a n o c y t e s d e chaque échantillon e n rem plaçant l e m é t a b i s u l f i t e d e sodium par l e N a C l 0 ,9 % e t traités dans les m ê m e s conditions.

L e pourcentage d e f a l c i f o r m a ti o n a été calculé d'après l a form u l e :

n

F( % ) = X ??00

N ??

n = nombre d e d r é p a n o c y t e s ; N t = nombre t o t a l d e s h é m a t i e s d é n o m b r é e s ( J o p p a e t a l ., 2 0 0 8 ) .

I I .3 .3 .2 . Évaluation d e l'activité i n h i b i t r i c e d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur

l a f a l c i f o r m a t i o n .

L e s extraits d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s ( préparés dans l e N a C l 0 ,9 % ) ont été utilisés pour l'évaluation d e l'activité inhibitrice de la f a l c i f o r m a t io n e n présence d u sang e t d u M B S 2 % .

? Principe

L ' hypoxie induite par l e m é t a b i s u l f i t e d e sodium à 2 % ( M B S ) transform e les h é m a t ie s norm ales e n d r é p a n o c y t e s ( J o p p a e t a l ., 2 0 0 8 ) .

? M ode opératoire

Dans cinq tubes à e p p e n d o f f contenant 1 0 0 u L d e chaque solution d'extrait aux

c o n c e n t r a t i o n s d e 1 0 0 , 2 0 0 , 4 0 0 , 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L , o n t é t é a j o u t é s 5 0 u L d e sang S S e t 5 0 u L

d e solution d e m é t a b i s u l f i te d e sodium ( 2 % ) . L e s tubes ont été incubés à température ambiante pendant 2 h 3 0 m i n ( l e temps maximum d e l a f a l c i f o r m a t io n obtenu a u cours d e l ' i n d u c t i o n ) . L e s hématies totales e t les d r é p a n o c y t e s sont comptés a u microscope optique à l'aide d e l a cellule d e M a l a s s e z . L a phénylalanine a été utilisée comme c o n t r ô l e p o s i t i f a u x mêmes concentrations que les e x t r a i t s . P o u r a p p r é c i e r l ' a c t i v i t é inhibitrice d e chaque e x t r a i t , l e taux d'inhibition a été calculé par l a formule :

3 1

( % ) /N H = f0 - fn x 100

f0

O ù f 0 : est l e pourcentage d e falciform a t io n maxim a l e n présence d e sang HbS + M BS 2 %

f n : l e pourcentage d e falciform a ti o n minim a l e n présence d e sang HbS + M B S 2 % + extrait

(Joppa e t a l ., 2 0 0 8 )

I I .3 .3 .3 . Évaluation d e l ' e f f e t des extraits d e Spirulina platensis sur l a réversibilité d e l a falciform ation.

· Principe :

L a réversibilité d e l a falciform a t i o n d e basée sur l a réduction d u pourcentage d e falciform a t io n initiale après incubation d u sang avec l ' e x t r a i t .

· M ode opératoire :

L ' e f f e t d e l ' e x t r a i t sur l a réversibilité d e l a falciform a t i o n a été réalisé e n incubant 5 0 u L d e sang à température ambiante avec 5 0 u L d e l ' e x t r a i t aux différentes concentrations pendant 2 h , 4 h , 2 4 h . L e pourcentage d e falciform a t i o n a été calculé avant e t après les incubations. L e pourcentage d e falciform a t i o n est alors d é t e r m i n é d e l a même façon que précédemment. Les pourcentages obtenus nous ont p e r m i s d e calculer les différents taux d e réversibilité d e l a falciform ation ( % R ) selon l a form ule suivante :

( % ) R = f0- fn x 100

f0

F 0 : est l e pourcentage d e falciform ation initiale e t F n l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n minim ale obtenue e n présence d ' e x t r a i t o u d e phénylalanine (Joppa e t a l ., 2 0 0 8 ) .

Les concentrations ayant montrés des meilleurs activités antifalcém iantes ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) ont été utilisées pour évaluer i n vitro l ' a c t i v é antihém olytique d e l ' e x t r a i t aqueux d e spiruline.

I I .3 .4 . Évaluation i n vitro d e l ' a c t i v i t é antihém olytique d e l ' e x t r a i t aqueux d e Spirulina

platensis

L ' e f f e t antihém olytique d e l ' e x t r a i t d e plante est évalué i n vitro sur les érythrocytaire. C e dernier est facile à isoler d u sang e t s a membrane présente des sim ilitudes avec d'autres membranes cellulaires ( S h o b a n a e t V i d h y a , 2 0 1 6 ) .

3 2

I I .3 .4 .1 . Préparation d e l a suspension é r y t h r o c y t a i r e

L e sang utilisé p o u r p r é p a r e r l e s suspensions é r y t h r o c y t a i re s a été prélevé dans des tubes E D T A chez des patients d r é p a n o c y t a i r e s homozygotes S S . Après centrifugation à 3 0 0 0 t rs p e n d a n t 5 m i n , l e c u l o t r é c u p é r é e s t l a v é 3 fois avec l a solution PBS i s o - s a l i n e f o r m é e d e tampon phosphate d e potassium 1 0 m M , p H = 7 ,4 e t 1 5 4 m M d e N a C l . Chaque lavage consistait e n une suspension des cellules dans d u PBS I s o salin e t une centrifugation à 3 0 0 0 t r s pendant 5 m i n . Après l a dernière centrifugation, l e culot est r e s u s p e n d u à nouveau dans une solution d u PBS i s o - s a l i n à raison d e 1 volume d u culot e t 9 volumes d u PBS, permettant ainsi d'obtenir u n h é m a t o c r i t e à 1 0 % ( Rani e t a l . , 2 0 1 4 ) .

I I .3 .4 .2 . M i s e a u point des tests d e l ' h é m o l y s e induite i n vitro par différents inducteurs

Pour tester l'effet a n t i h é m o l y t i q u e d e notre extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s , les deux concentrations 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ayant montré des meilleures activités a n t i f a l c é m i a n te s ont été utilisées. A u préalable, des tests sur modèle é r y t h r o c y t a i r e d e l ' h é m o l y s e induite par différents agents « milieu hypotonique, acide salicylique, triton X - 1 0 0 e t l ' H 2 O 2 ) ont été faits e n absence d e l'extrait afin d e d é t e r m i n e r l a concentration qui induit une h é m o l y s e maximale.

? Principe :

L ' e x p o s i t i o n des globules rouges ( R B C ) à certains conditions p h y s i c o chimiques tels que l e milieu h y p o t o n i q u e , l ' u t i l i s a ti o n d'un p e r t u r b a t e u r m e m b r a n a i r e comme les détergents o u les espèces réactifs oxygénées ( R O S ) , provoque une rupture d e s a membrane cytoplasm i q u e provoquant ainsi l a libération d e l ' h é m o g l o b i n e qui sera alors dosée par spectrophotométrie d ' a b s o r b a n c e visible à 5 4 0 n m .

? Induction par l'aspirine

? M ode opératoire

À 4 . 5 m L d e N a C l hypotonique ( 4 ,5 m g / m L ) , ont été ajouté 5 0 ì L d e l'aspirine d e concentrations variant entre 0 e t 0 , 7 m g / m L préparées à partir d e comprimés d'aspirine d e 1 0 0 0 m g . L e tube t é m o i n reçoit l e m ê m e v o l u m e d u tampon phosphate i s o - salin ( P B S ) , puis une quantité d e 5 0 0 ì L d e l a suspension é r y t h r o c y t a i r e est ajoutée dans chaque tube. Ces tubes sont ensuite homogénéisés e t incubés à 3 7 ? C pendant 3 0 min dans u n bain marie. Les tubes sont centrifugés ( 3 0 0 0 t r s ; 5 m i n ) e t l ' a b s o r b a n c e d e s u r n a g e a n t e s t m e s u r é e à 5 4 0 n m ( H o u c h e r e t a l ., 2 0 0 1 ) .

? Induction hypotonique

? M ode opératoire :

Afin d e déterminer l a concentration d u N a C l qui provoque l a lyse des globules rouges, o n a additionné 1 0 0 u L d e l a suspension érythrocytaire ( 1 0 % ) à 5 m L d e N a C l à différentes concentrations ( 3 ,5 - 8 ,5 m g / m L ) , ainsi q u ' u n témoin négatif ( N a C l isotonique 9 m g / m L ) e t u n témoin positif ( l ' e a u distillée). Après incubation pendant 3 0 m i n à température ambiante, l e mélange a été centrifugé 1 0 m i n à une vitesse d e 3 0 0 0 t r s , à l a fin o n a effectué une lecture des densités optiques à 5 4 0 n m ( L o u e r r a d e t a l ., 2 0 1 6 ) .

? Induction par l e triton X - 1 0 0

? M ode opératoire :

Huit cent m icrolitres d u triton-100 à différentes concentrations ( 0 ,0 0 1 % , 0 ,0 3 % , 0 ,0 4 % , 0 ,0 5 % , 0 ,1 % , 1 % ) ont été m élangés avec 2 ,2 m L d u tampon phosphate ( 0 ,2 M , p H = 7 ,4 contenant 0 ,9 % d e N a C l ) e t 5 0 0 u L d e l a suspension érythrocytaire ( 1 0 % ) . L e m élange a été incubé 1 h , à 3 7 ° C , puis centrifugé à 3 0 0 0 r p m pendant 5 m i n . L a densité optique d u surnageant a été mesurée à 5 4 0 n m , o n a préparé d e même façon l e contrôle m ais e n absence d u triton - 1 0 0 ( M uthu e t D u r a i r a , 2 0 1 5 ) .

? Induction par l e peroxyde d ' h y d r o g è n e H 2 O 2

? M ode opératoire :

5 0 0 u L d e H 2 O 2 à différentes concentrations initiales ( 9 % ; 6 % ; 3 % ; 1 % ; 0 ,5 % ; 0 ,3 % ; 0 ,2 % ) ont été m élangés avec u n volume d e 2 5 0 u L d e l a suspension d e globules rouges, après une durée d e 3 h d ' i n c u b a t i o n à 3 7 ° C , o n a ajusté par l e PBS j u s q u ' à 4 ,5 0 0 m L puis l e m élange a été soumis à une centrifugation pendant 1 0 min avec une vitesse d e 3 0 0 0 t r s . L ' a b s o r b a n c e des surnageants a été lue à 5 4 0 n m . Les contrôles ont été préparés e n rem plaçant l ' H 2 O 2 par l ' e a u distillée pour l e contrôle positif e t par l a solution PBS pour l e contrôle négatif (Jam e s e t A l e w o , 2 0 1 4 ) .

? Calcule des taux d ' h é m olyse

L e pourcentage d ' h é m o l y s e pour tous les tests a été calculé e n appliquant l a formule suivante (Shobana e t Vidhya, 2 0 1 6 ) :

% d' hé m olyse =

Ales du test

x 100 Avec Abs = Absorbance

 
 

3 3

Ales du contrôle

I I .3 .4 .3 . M esure d e l ' e f f e t a n t i h é m olytique d e l ' e x t r a i t s d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur chaque

inducteur

L e taux d ' i n h i b i t i o n d ' h é m o l y s e pour tous les tests a été calculé e n appliquant l a f o r m u le

suivante ( S hob a n a e t V i d h y a , 2 0 1 6 ) :

% d 'inhibition d'

hém olyse =

Abs du contrô le- Abs du test

x 100 Avec Abs = Absorbance

 
 

3 4

Abs du contrôle

? Effet d e l ' e x t r a i t sur l ' h é m olyse induite par l ' a s p i r i n e

Cinq cent m icrolitres d e l ' e x t r a i t à différentes concentrations ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) ont été additionné à 2 5 0 ì L d e l a suspension érythrocytaire e t incubé 5 m i n , p u i s 2 5 ì L d e l ' a s p i r in e à une concentration d e 0 , 7 m g / m L ont été ajoutés avec 1 7 5 0 u L d u N a C l hypotonique ( 0 , 4 5 % ),

l e mélangea été homogénéisé e t incubé pendant 1 h à 3 7 ? C puis centrifugé à 3 0 0 0 t r s pendant 5

m i n , les densités optiques des surnageants ont été lues à 5 4 0 n m . U n contrôle e n absence d e

l ' e x t r a i t dans les m ê m e s conditions e n remplaçant l e volume d e l ' e x t r a i t par l e N a C l 0 ,4 5 % e t u n standard (quercétine) ont été réalisé ( H oucher e t a l ., 2 0 0 1 ) .

? Effet d e l ' e x t r a i t sur l ' h é m olyse induite par l a solution hypotonique ( N a C l )

Cinquante m icrolitres d e l ' e x t r a it à différentes concentrations ( 8 0 0 - 1 6 0 0 u g /m L ) , ont été

m é l a n g é s avec 5 0 ì L d e l a suspension érythrocytaire, après une incubation d e 1 0 m i n à température ambiante, 2 , 5 m L d u N a C l à une concentration d e 0 , 3 5 % ont été ajoutés. L e mélange est laissé incubé à 3 7 ° C pendant 3 0 min puis centrifugé à 3 0 0 0 t r s p e n d a n t 1 0 min. L ' a b s o r b a n c e d u surnageant a été lue à 5 4 0 n m , d e même U n contrôle e n absence d ' e x t r a it

rem placé par l e même volume d e N a C l 0 , 3 5 % e t u n standard (quercétine) ont été réalisé
(Louerrad e t a l ., 2 0 1 6 ) .

? Effet d e l ' e x t r a i t sur l ' h é m olyse induite par l e triton X - 1 0 0

U n volume d e 5 0 0 u L d ' e x t r a i t s à différentes concentrations ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) a été ajouté à 2 5 0 ì L d e l a suspension érythrocytaire, l e m élange a été incubé pendant 5 min à une température ambiante, puis additionné 4 0 0 ì L d u détergent triton X - 1 0 0 à 1 % ; après une incubation d ' u n e heure à 3 7 ° C suivie d ' u n e centrifugation à 3 0 0 0 t r s pendant 1 0 m i n , une lecture des D O à 5 4 0 n m a été réalisée. L e contrôle préparé e n absence d e l ' e x t r a i t rem placé par l e même volume e n tampon phosphate isosalin e t u n standard (quercétine) ont été réalisé ( M uthu e t D u r a i r a , 2 0 1 5 ) .

3 5

? Effet d e l'extrait d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l ' h é m o l y s e induite par l ' H 2 O 2

Deux cent cinquante m i c r o l i t r e s d e l a suspension é r y t h r o c y t a i r e e t 5 0 0 ì L d'extrait à différentes concentrations ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) ont été incubés pendant 3 0 min à température ambiante puis o n a ajouté 5 0 0 ì L d e H 2 O 2 ( 9 % ) , e t après une incubation pendant 3 h à 3 7 ° C , o n a ajusté l e volume f i n a l à 4 5 0 0 ì L par le PBS, à l a fin une centrifugation à 3 0 0 0 t r s pendant 1 0 min e t une lecture des D O à 5 4 0 n m e t d e même façon o n a réalisé l e test standard e n utilisant l a q u e r c é t i n e comme molécule d e r é f é r e n c e . L e contrôle a été réalisé e n absence d'extrait e t e n présence d e l'eau distillée. ( Jam e s e t A l e w o , 2 0 1 4 ) .

I I .4 . A N A L Y S E S STATISTIQUES E T EXPRESSION DES RÉSULTATS

Pour chaque activité ci-dessus , les tests ont été effectués par groupe d e q u a d r u p l e t s , l e s résultats classés sous form e d e moyen #177; écart type standard, les calculs, les courbes e t diagrammes étaient faits à l'aide d u logiciel Excel 2 0 1 3 e t les données ont été analysées e n utilisant l'analyse d e variance à u n facteur ( One Way ANOVA) suivi d u test Post-hot d e D u n n e t t pour les c o m paraisons multiples.

précédent sommaire suivant






Bitcoin is a swarm of cyber hornets serving the goddess of wisdom, feeding on the fire of truth, exponentially growing ever smarter, faster, and stronger behind a wall of encrypted energy








"Je ne pense pas qu'un écrivain puisse avoir de profondes assises s'il n'a pas ressenti avec amertume les injustices de la société ou il vit"   Thomas Lanier dit Tennessie Williams