Memoire Online - Evaluation in vitro des propriétés antifalcémiantes et antihémolytiques de l'extrait aqueux de spirulina platensis (oscillatoriaceae) du Cameroun

L e r e n d e m e n t d ' e x t r a c t i o n obtenu à l'issu d e l a macération aqueuse était d e 1 4 ,0 1 5 % .

I I I .1 .2 . E f f e t d e L ' extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s à différentes con centrations sur l a f a l c i f o r m a t i o n .

I I I .1 .2 .1 . I n d u c t i o n i n vitro d e l a f a l c i f o r m a t i o n par le m é t a b i s u l f i t e d e sodium ( M B S ) 2 %

L a figure 7 présente l e pourcentage d'induction d e l a f a l c i f o r m a t i o n e n fonction d u temps d'induction des globules rouges d r é p a n o c y t a i r e s avec l e M B S ( 2 % ) .

Figure 7 : Pourcentage d'induction d e l a f a l c i f o r m a t i o n e n fonction d u temps d'induction des globules rouges d r é p a n o c y t a i r e s avec l e M B S ( 2 % ) .

I l ressort que l e sang S S additionné a u M B S 2 % ( V / V ) a induit l a f a l c i f o r m a t i o n des h é m a t i e s . A u temps i n i t i a l T = 0 ( heure), ( o ù l e M B S 2 % était remplacé par l e N a C l 0 ,9 % ) l e pourcentage moyen d e f a l c i f o r m a ti o n é t a i t d e 2 7 ,9 9 #177; 3 ,1 5 % . A u bout d e 2 h 3 0 m i n d'induction, c e pourcentage est passé à 9 1 ,3 8 #177; 1 ,2 2 % soit 6 9 ,3 0 % d'induction d e l a f a l c i f o r m a t i o n . L e maximum d e d r é p a n o c y t e s atteint, c e temps ( 2 h 3 0 m i n ) a été considéré comme celui d e l a f a l c i f o r m a t io n maximale.

I I I .1 .2 .2 . A c t i v i t é inhibitrice d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s à différentes concentrations sur l a f a l c i f o r m a t i o n .

L a figure 8 ci-dessous présente l a variation des pourcentages d e f a l c i f o r m a t i o n des h é m a t i e s S S e n fonction des différentes concentrations d'extrait e t d e phénylalanine ( contrôle positif).

Figure 8 : Pourcentage d e l a f a l c i f o r m a ti o n e n fonction d e l a concentration e n extrait e t d e l a phénylalanine a 2 h 3 0 m i n .

* = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine.

I l découle d e cette figure 8 qu'après 2 h 3 0 m i n d'incubation d e s h é m a t i e s S S e n présence d u M B S 2 % ( t é m o i n négatif), l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n variait s i g n i f i c a t i v e m e n t d e 2 0 ,9 8 #177; 1 ,7 2 % à 7 7 ,4 3 #177; 3 .5 2 % à ( p < 0 ,0 5 ) . Par ailleurs, nous observons une différence significative entre l e témoin négatif e t les concentrations 4 0 0 u g / m L , 8 0 0 u g / m L ; 1 6 0 0 u g / m L d e phénylalanine d'une part, e t d'autre part, entre l e t é m o i n négatif e t les concentrations 8 0 0 u g / m L ; 1 6 0 0 u g / m L d e l ' e x t r a i t . E n outre, i l e s t à noter qu'aucune différence significative n ' a été observée entre les différentes concentrations d'extrait e t d e phénylalanine à différentes concentrations. L'analyse statistique montre une corrélation négative entre l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n e t l a concentration d'extrait o u d e phénylalanine ( pour l'extrait o n a r = - 0 ,8 6 4 ; p = 0 ,0 0 0 e t p o u r l a phénylalanine o n a r = 0 ,7 9 2 ; p = 0 ,0 0 0 )

L a figure 9 représente l ' é t a t m o r p h o l o g i q u e des h é m a t i e s d'un d r é p a n o c y t a i r e observées a u microscope optique ( o b j e c t i f 4 0 x ) après 2 h 3 0 m i n d'incubation e n présence d e M B S 2 % plus e x t r a i t d e spiruline à l a concentration 1 6 0 0 u g / m L ( figure 9 .1 ) e t e n présence d e M B S 2 % sans extrait ( figure 9 .2 ) . E n ( figure 9 .2 ) , i l y a une p r é d o m i n a n c e des d r é p a n o c y t e s

com p a r a t i v e m e n t à ( figure 9 .1 ) . C e c i t é m o i g n e l'effet inhibiteur d e l'extrait d e s p i r u l i n e ( fig u re 9 ) .

Figure 9 : Etat morphologique des hématies d'un d r é p a n o c y t a i r e observées a u microscope optique.

L a figure 1 0 ci-dessous ressort les différents taux d ' i n h i b i t i o n d e l a f a l c i f o r m a tio n obtenus à différentes concentrations d e l'extrait.

Figure 1 0 : T aux d'inhibition d e l a f a l c i f o r m a t io n e n fonction d e l a concentration d'extrait e t d e phénylalanine.

* = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine.

Les taux d'inhibition varie d e 1 5 ,1 0 #177; 0 ,6 0 % à 6 6 ,0 9 #177; 4 ,6 9 % pour les concentrations d e

1 0 0 à 1 6 0 0 u g / m L d'extraits d e spiruline e t d e 2 3 ,8 5 #177; 6 ,2 1 % à 6 9 ,6 4 #177; 1 1 ,9 0 % pour les mêmes concentrations respectives d e phénylalanine e t n u l p o u r l e t é m o i n n é g a t i f s a n s extrait.

I I I .1 .2 .3 . Évaluation i n vitro d e l'activité l'extrait d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l a réversibilité

Les annexes III, I V , V présentent l'activité d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l a réversibilité d e

Nous avons obtenu une baisse d e pourcentage d e f a l c i f o r m a ti o n i n i t i a l e n fonction d e l a concentration après 2 h , 4 h e t 2 4 h d'incubation avec l'extrait. Après 2 h , i l p a s s e d e 5 4 ,4 6 #177; 3 ,2 5 %

à 3 2 ,8 6 #177; 4 ,8 2 % e t d e 5 4 ,4 6 #177; 3 ,2 5 % à 2 4 ,4 7 #177; 1 ,6 7 % pour l'extrait e t l a p h é n y l a m i n e
r e s p e c t i v e m e n t . P a r a i l l e u r s , a p r è s 4 h d'incubation q u i i l p a s s e d e 5 4 ,4 6 % à 2 2 ,0 5 #177; 3 ,9 7 % e t d e 5 4 ,4 6 % à 2 0 ,4 9 #177; 3 ,2 6 % pour les concentrations d'extrait e t d e phénylalanine respectivement. Enfin après 2 4 h d'incubation i l varie d e 5 4 ,4 6 % à 9 ,5 7 #177; 3 ,1 0 % e t d e 5 4 ,4 6 % à 2 0 ,4 9 #177; 3 ,2 5 % pour les concentrations d ' e x t r a i t e t d e l a p h é n y l a l a n i n e r e s p e c t i v e m e n t. P a r c o n t r e , o n a observé une faible a u g m e n t a t i o n d u pourcentage d e f a l c i f o r m a t i o n dans l e t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine par rapport a u pourcentage d e f a l c i f o r m a ti o n initial. L e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n initial passe d e 5 4 ,4 6 % à 7 2 ,0 2 % entre l e temps initial e t 2 4 h ( annexes III, I V ,

L'analyse statistique ressort qu'après 2 h e u r e s i l y a une différence entre l e pourcentage

d e f a l c i f o r m a t io n initial comparé à ceux d e toutes les concentrations mais seuls ceux des
c o n c e n t r a t i o n s 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L s o n t s i g n i f i c a t i f s ( p < 0 ,0 5 ) . E n o u t r e , a p r è s 4 h e u r e s e t

2 4 heures d'incubation toutes les concentrations d'extrait e t phénylalanine réduisent significativement ( p < 0 ,0 5 ) l e pourcentage d e f a l c i f o r m a ti o n e n comparaison avec l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t i o n i n i t i a l. D e p l u s , p o u r une même concentration l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n diminue avec l e temps. Nous notons aussi, une corrélation négative ( p < 0 ,0 1 ) entre l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t i o n e t l a concentration d'extrait o u d e p h é n y l a m i n e pour tous les intervalles d e temps ( (pour l ' e x t r a i t a p r è s 2 h o n a ( r = - 0 ,7 2 6 ; p = 0 ,0 0 0 ) ; 4 h ( r = - 0 ,8 1 1 ; p = 0 ,0 0 0 ) ; 2 4 h ( r = - 0 ,9 4 0 ; P = 0 ,0 0 0 ) e t pour l a phénylalanine o n a après ( 2 h ( r = - 0 ,7 2 3 ; p = 0 ,0 0 0 ) ; 4 h ( r = - 0 ,8 1 1 ; p = 0 ,0 0 0 ) ; 2 4 h ( r = 0 ,9 0 5 ; p = 0 ,0 0 0 ) ) : plus l a concentration d'extrait o u d e phénylalanine est grande plus l e pourcentage d e f a l c i f o r m a ti o n e s t p e t i t . Alors l e taux d e r é v e r s i b i l i t é d e l a f a l c i f o r m a t io n e s t c o n c e n t r a t i o n - d é p e n d a n t e t v a r i e avec l e temps.

Les figures 1 1 , 1 2 , 1 3 , nous m o n t r e n t r e s p e c t i v e m e n t l e s graphes d e taux réversibilité d e f a l c i f o r m a t io n e n fonction d e l a concentration e n e x t r a i t e t p h é n y l a l a n i n e après 2 h , 4 h , 2 4 h .

Figure 1 1 : T aux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t io n après 2 h e n fonction d e l a concentration. * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine.

Figure 1 2 : T aux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t io n après 4 h e n fonction d e l a concentration. * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u témoin négatif sans extrait e t s a n s phénylalanine.

Figure 1 3 : Taux d e réversibilité de la f a l c i f o r m a t i o n a p r è s 2 4 h e n fonction d e l a concentration. * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine. Les figures 1 4 e t 1 5 présentent les différents taux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a tio n e n fonction d u temps d'incubation.

Figure 1 4 : Taux d e réversibilité e n fonction d u temps a l a concentration 8 0 0 u g / m L .

* = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine .

F i g u r e 1 5 : T a u x d e r é v e r s i b i l i t é e n f o n c t i o n d u t e m p s a l a c o n c e n t r a t i o n 1 6 0 0 u g / m L .

* = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine .

I l ressort qu'il existe une différence significative à ( p < 0 ,0 5 ) pour les différents temps d'incubation aux concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L . L e s différents taux d e réversibilité étant d e 3 7 ,5 4 #177; 6 ,3 5 % ; 4 4 ,2 2 #177; 6 ,8 3 % ; 7 4 ,9 0 #177; 8 ,5 3 % aux t e m p s r e s p e c t i f s 2 h ; 4 h ; 2 4 h pour l a concentration 8 0 0 u g / m L d'extrait e t d e 3 9 ,7 5 #177; 2 ,3 1 ; 5 9 ,3 8 #177; 7 ,4 1 ; 8 2 ,3 4 #177; 5 ,6 3 % pour l a concentration 1 6 0 0 u g / m L respectivement aux mêmes temps. L a phénylalanine présente les taux d e 3 2 ,1 6 #177; 2 ,9 9 % ; 4 2 ,0 3 #177; 7 ,7 3 % ; 6 2 ,4 6 #177; 8 ,0 3 % pour l a concentration 8 0 0 u g / m L e t d e 4 5 ,9 6 #177; 2 ,9 9 % ; 5 5 ,3 7 #177; 1 5 ,0 4 % ; 7 2 ,4 5 #177; 3 ,2 5 % pour l a concentration 1 6 0 0 u g m L .

D e nombreuses études ont montré que les membranes plasm a t i q u e s des hématies hum a i n s ont des stabilités variables e n fonction d u milieu dans l e q u e l e l l e s s e trouvent ( I b e h e t a l ., 1 9 9 2 ) . Dans l e cadre d e l a gestion des patients souffrant d e l a d r é p a n o c y t o s e , l a recherche d e molécules o u d e substances actives capables d e protéger l'intégrité m e m b ra n a ir e des hématies devient d e plus e n plus importante. C'est ainsi que nous avons procédés aux tests a n t i h é m o l y t i q u e s e n utilisant différents modèle d e substance prouvant créer une h é m o l y s e des h é m a t i e s .

I I I .1 .3 .1 . A c t i v i t é a n t i h é m o l y t i q u e d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l'Aspirine

L a f i g u r e l'induction d e l ' h é m o l y s e à différentes concentrations d'aspirine.

Figure 1 6 : Pourcentage d ' h é m o l y s e induite par différentes concentrations d'aspirine.

Les résultats obtenus ( figure 1 6 ) présentent une hémolyse maximale e t significative ( p ? 0 ,0 5 ) d e 8 3 ,9 4 #177; 4 ,0 5 % à l a concentration d e 0 ,7 m g / m L d e l'aspirine c o m p a r a t i v e m e n t a u témoin négatif ( l'aspirine était remplacée par l e PBS) 9 ,2 4 #177; 1 ,4 8 % . 1 0 0 % d'hémolyse sont obtenus pour l e contrôle positif.

L a figure 1 7 présente l e pourcentage d ' h é m o l y s e induite par l'aspirine à l a concentration d e 0 ,7 m g / m L e n présence d e l'extrait e t d e l a q u e r c é t i n e .

Figure 1 7 : Pourcentage d ' h é m o l y s e i n d u i t e p a r l ' a s p i r i n e ( 0 ,7 m g / m l ) e n présence d e l'extrait.

* * = p < 0 , 0 1 , * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans q u e r c é t i n e . Les histogrammes d e mêmes lettres n e s o n t p a s significativement différentes p < 0 , 0 5

L a figure 1 8 montre l e taux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l'aspirine à l a

Figure 1 8 : T aux d'inhibition d e l'extrait sur L ' h m o l y s e induite par l'aspirine 0 ,7 m g / m L .

L'étude d e l'effet d'inhibition des différentes concentrations d'extrait d e spiruline sur l'hémolyse induite par l'aspirine montre que les c o n c e n t r a t i o n s 8 0 0 u g /m L e t 1 6 0 0 u g / m L

d'extraits présentent des activités a n t i h é m o l y t i q u e s significatives à p < 0 ,0 5 ( p = 0 ,0 0 0 ) par
rapport a u contrôle négatif sans extrait e t sans q u e r c é t i n e . Nous notons également une différence significative ( p = 0 ,0 0 0 ) entre les concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L d'extraits d'une part, e t d'autre part entre l'extrait e t l a q u e r c é t i n e aux m ê m e s concentrations sus-cités.

I I I .1 .3 .2 . A c t i v i t é a n t i h é m o l y t i q u e d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e hypotonique

L a figure 1 9 présente l'induction d e l ' h é m o l y s e à différentes concentrations d e N a C l .

Figure 1 9 : Pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration e n N a C l .

Les résultats d e l'hémolyse i n vitro réalisée sur les globules rouges des d r é p a n o c y t a i r e s par la solution hypotonique d u N a C l ( Figure 1 9 ) m o n t r e n t q u e l e maximum d'hémolyse est obtenu à l a concentration 0 ,3 5 % d e N a C l avec u n taux d'hémolyse d e 7 8 ,0 5 #177; 8 ,1 0 % . E n effet, plus l e milieu est concentré e n N a C l , plus l e taux d'hémolyse des globules diminue. L'activité h é m o l y t i q u e l a plus élevée est observée dans l e milieu l e moins c o n c e n t r é , c ' e s t - à - d i r e l e plus hypotonique ( 0 ,3 5 % ) , tandis que dans l e milieu s e rapprochant d e l ' i s o t o n i c i t é , à partir d e l a

concentration 0 ,5 5 % , l e taux d'hémolyse diminue e t jusqu'à atteindre u n minimum d e
1 4 ,4 0 #177; 1 ,7 1 % à l a c o n c e n t r a t i o n e n N a C l 0 ,8 5 % .

L a figure 2 0 présente l e taux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o ly s e induite par le milieu

Figure 2 0 : T aux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e milieu hypotonique ( N a C l 0 ,3 5 % ) .

Les résultats d e l'évaluation d e l'activité d'inhibition d e l'extrait e t q u e r c é t i n e sur l ' h é m o l y s e induite par l a solution hypotonique N a C l 0 ,3 5 % montre que les concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L d'extrait e t d e q u e r c é t i n e inhibent l ' h é m o l y s e . L ' analyse statistique montre que l'extrait d e spiruline e t l a q u e r c é t i n e à des c o n c e n t r a t i o n s , 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L inhibent significativement ( p ? 0 ,0 5 ) l ' h é m o l y s e . A u c u n e différence significative n ' a été observée entre les différentes concentrations d'extrait e t d e q u e r c é t i n e aux deux concentrations.

I I I .1 .3 .3 . Activité a n t i h é m o l y t i q u e d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e détergent Triton X - 1 0 0

L a figure 2 1 révèle l e pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration d u t r i t o n X - 1 0 0

Figure 2 1 : Pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration d u triton-100.

Des résultats obtenus, nous notons une différence significative entre l'effet d u triton - 1 0 0 aux concentrations utilisées e t les contrôles négatifs pour lequel l e triton est remplacé par l e PBS.

U n taux d'hémolyse d e 1	0 0	#177; 0	,0 0	% ;	9 7	,9 5	#177; 1	,7 4	;	9 8 ,7 7 #177; 0 ,5 8 ; 8 4 ,4	3 #177; 2 ,0 3 est obtenu pour l a
concentration d e triton 1	%	; 0	,1 %	; 0	,0 5	%	; 0	,0 4	%	respectivement.

L a figure 2 2 présente l e taux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e

Figure 2 2 : Taux d'inhibition d e l'extrait sur l'hémolyse induite par l e triton-100 à l a

* * = p < 0 , 0 1 , * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u témoin négatif sans extrait n e t sans q u e r c é t i n e . Les histogrammes d e mêmes lettres n e s o n t p a s significativement différentes p < 0 , 0 5

L e s résultats d e l'évaluation d e l'inhibition d e l'extrait e t d u standard sur l ' h é m o l y s e induite par l e triton X - 1 0 0 à l a concentration 1 % montre que l ' e x t r a i t d e spiruline e t l a q u e r c é t i n e ont des activités inhibitrices d ' h é m o ly s e é l e v é e s . E n effet, i l existe u n e différence s i g n i f ic a t iv e entre l e t é m o i n négatif e t l'extrait ( 8 0 0 u g /m L , p = 0 ,0 3 0 ) . E n revanche, à l a concentration 1 6 0 0 u g / m L , l'extrait e t l a q u e r c é t i n e inhibent significativement ( p < 0 ,0 5 ) l'hémolyse. M ais aucune différence s i g n i f i c a t i v e ( p > 0 ,0 5 ) n'est observée e n t r e l'effet i n h i b i t e u r d e l'extrait e t celui d e l a q u e r c é t i n e étudiée p a r a l l è l e m e n t à la m ê m e concentration, 8 0 0 u g / m L ( p = 0 ,5 3 4 ) o u 1 6 0 0 u g / m L ( p = 0 ,7 6 7 ) . Les différents taux d'inhibition d'hémolyse obtenus pour les concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L sont respectivement d e ( figure 2 3 ) 3 6 ,5 9 #177; 9 ,5 3 % ; 4 5 ,9 5 #177; 1 0 ,7 1 % p o u r l ' e x t r a i t e t 4 5 ,6 7 #177; 2 2 ,5 5 % ; 5 7 ,8 8 #177; 1 5 ,3 3 % p o u r l a q u e r c é t i n e a u x m ê m e s c o n c e n t r a t i o n s .

I I I .1 .3 .4 . Activité a n t i h é m o l y t i q u e d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e peroxyde
d'hydrogène

L a f i g u r e 2 3 p r é s e n t e l e p o u r c e n t a g e d ' h é m o l y s e e n f o n c t i o n d e l a c o n c e n t r a t i o n e n

Figure 2 3 : Pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration e n peroxyde d'hydrogène. L e s résultats d e l'étude d e l ' h é m o l y s e induite par l e peroxyde d'hydrogène montrent que toutes les concentrations d e peroxyde d'hydrogène étudiées induisent plus o u moins l'hémolyse par comparaison d e leurs pourcentages d e l'hémolyse à celui d u témoin négatif qui a donné

2 6 ,8 3 #177; 5 ,1 0 % . E n effet les concentrations allant d e 0	,2 %	à 9	%	d e peroxyde d'hydrogène ont
i n d u i t r e s p e c t i v e m e n t l e s h é m o l y s e s d e 4 3 ,3 7 #177; 6 ,2 7 %	à 8 2	,2 1	#177; 4	,2 5 % . Par comparaison avec l e

témoin négatif, une hémolyse maximale plus significative ( p < 0 ,0 5 ) est obtenue à l a concentration 9 % d e peroxyde d'hydrogène.

L a figure 2 4 présente l e taux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e

Figure 2 4 : Taux d'inhibition d e l ' e x t r a i t s u r l'hémolyse induite par l e peroxyde d'hydrogène

* * = p < 0 , 0 1 , * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans

q u e r c é t i n e . Les histogrammes d e mêmes lettres n e s o n t p a s significativement différentes p < 0 , 0 5

L'étude d e l'activité d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e peroxyde d'hydrogène montre que l'effet e s t p l u s prononcé pour l a concentration 1 6 0 0 u g / m L que celle d e 8 0 0 u g / m L t a n t p o u r l ' e x t r a i t q u e p o u r l a q u e r c é t i n e . C e p e n d a n t , l ' a n a l y s e s t a t i s t i q u e m o n tre que seul l a concentration 1 6 0 0 u g / m L d'extrait e t d u standard inhibe s i g n i f i c a t i v e m e n t ( p < 0 ,0 5 ) l'hémolyse induite par le peroxyde d'hydrogène à l a concentration 9 % par comparaison avec l e t é m o i n négatif. L ' effet c o m paré d'inhibition d e l a q u e r c é t i n e e t d e l'extrait n e révèle aucune différence significative ( p > 0 ,0 5 ) pour l a concentration 8 0 0 u g / m L ( p = 0 ,9 1 1 ) e t celle 1 6 0 0 u g / m L ( p = 0 ,5 9 4 ) . D e m ê m e , a u c u n e différence s i g n i f i c a t i v e n ' e s t o b s e r v é entre l'activité inhibitrice d e l ' e x t r a i t à s a concentration 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L ( p = 0 ,0 5 8 ) e t idem p o u r l a q u e r c é t i n e à ces deux c o n c e n t r a t i o n s ( p = 0 ,1 1 5 ) .

L ' extraction constitue une étape prim o r d i a l e dans l'évaluation d e l'activité biologique des plantes naturelles. L e rendement obtenu a u cours d e notre étude était d e 1 4 ,0 1 5 % . Cette valeur est inférieure à celle obtenue par A m a e t a l . ( 2 0 1 6 ) qui, lors d'une extraction aqueuse

d e spiruline ont obtenu u n rendement d e 1 6 ,8 4 % . Cette variation pourrait s'expliquer par l a différence d e taux d ' h u m i d i t é d e nos différents l y o p h i s a t s et/ou leurs degrés d e pureté ( N a c z k

L'évaluation d e l'activité a n t i f a l c é m i a n te ( inhibition e t l a réversibilité) d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s a été faite à différentes concentrations e n présence d u sang des d r é p a n o c y t a i r e s homozygotes S S . E n e f f e t , n o u s avons observé e n présence d u M B S 2 % une différence significative à ( p ? 0 ,0 5 ) entre l e contrôle négatif ( absence d'extrait) e t les concentrations d e l'extrait ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) . Les taux d'inhibitions d e l a f a l c i f o r m a tio n étant concentration-dépendant e t variant entre 1 5 ,1 0 #177; 0 ,6 0 % e t 6 6 ,0 9 #177; 4 ,6 9 % . E n effet, S a w a d o g o e t a l . ( 2 0 1 7 ) ont obtenu dans une étude menée a u Burkina Faso sur les patients d r é p a n o c y t a i r e s u n taux d'inhibition d e 9 7 % à l a concentration d e 2 0 0 m g / m L avec l e macéré aqueux total d e J a t r o p h a c u r c a s . Par ailleurs D j o t é e t a l . ( 2 0 2 0 ) ont montré dans une étude menée a u Cam e r o u n sur les patients d r é p a n o c y t a i r e s que les extraits d'huiles d ' A z a d i r a c h ta indica J inhibaient 7 7 ,6 6 #177; 1 , 3 % d e f a l c i f o r m a t io n e t avaient une activité d e réversibilité d e l a

f a l c i f o r m a t io n d e 6 2 ,2 6 #177; 4 .4 % . E n outre, l'activité d e l'extrait d e l a spiruline sur l a réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t io n montre que l'effet est aussi dose-dépendant, pour u n taux d e réversibilité m a x i m a l s i g n i f i c a t i f ( p < 0 ,0 5 ) d e 8 2 ,3 4 #177; 5 ,6 3 % contre 7 2 ,4 5 #177; 3 ,2 5 pour l a phénylalanine après 2 4 heures d'incubation des h é m a t i e s a v e c l ' e x t r a i t à l a concentration 1 6 0 0 u g / m L ( sans l e M B S à 2 % ) . C e taux d e réversibilité obtenue avec l ' e x t r a i t d e spiruline corrobore celui d e Seck e t a l . ( 2 0 1 5 ) qui ont obtenu 8 0 % d e réversibilité avec l ' e x t r a i t m é t h a n o l i q u e ( E M ) d e L e p t a d e n ia h a s t a t a D e c n e à 5 m g / m L e n 1 2 0 minutes. I l est supérieur à celui 3 9 ,5 #177; 3 ,3 6 % obtenu par N a n f a c k e t a l . ( 2 0 1 3 ) après 2 4 heures avec l ' e x t r a i t d e f r u i t d e X a n t h o x y l u m h e i t z i i 2 5 0 u g / m L . Les acides animés phénylalanine, tyrosine, a r g i n i n e ont révélé les propriétés a n t i f a l c i m i a n te s attribuées à leur activité d'inhibition d e l a p o l y m é r i s a t i o n d e l ' h é m o g l o b i n e S e t d ' a m é l i o r a tio n

d u rapport F e 2 + / F e 3 + ( N o g u c h i e t Shedder 1 9 7 8 ; E k e k e e t S h o d e , 1 9 9 0 ; N w a o g u i k p e e t

U w a k w e , 2 0 0 5 ) . Par ailleurs, Seck e t a l . ( 2 0 1 5 ) é t u d i a n t l ' a c t i v i t é a n t i f a lc é m ia n t e d'extraits d e racines d e L e p t a d e n i a h a s t a t a D e c n e ; N k e m e n i e t a l . ( 2 0 1 9 ) étudiant les propriétés a n t i f a l c é m i a n te s e t a n t i o x y d a n t e s des composés phénoliques extraits des grains d u haricot noir ( P h a s e o l u s v u l g a r i s L .) ont démonté l'implication d e ces groupes d e composés b i o a c t i f s dans

l'inhibition e t l a réversibilité d e l a f a l c i f o r 2 ... . m a t io n . Ainsi, l'activité a n t i f a l c é m i a n t e d e l'extrait d e l a Spiruline sur l a f a l c i f o r m a t i o n des h é m a t i e s à h é m o g l o b i n e S S s'expliquerait par

l a présence d e composés phénoliques e t ces acides aminés principalement l a tyrosine, l a phénylalanine e t l ' a r g i n i n e donc l a présence e t l a concentration est grande dans l a spiruline ( M a n n e t , 2 0 1 6 ; A m a e t a l ., 2 0 1 6 ) . C e r é s u l t a t t r è s proche entre l'activité d e l ' e x t r a i t b r u t d e l a spiruline comparée à celle d e l a phénylalanine ( standard) pourrait s'expliquer par u n effet synergique d e ces acides a m i n é s e t p o l y p h é n o l s présentes dans l'extrait qui, e n inhibant l a p o l y m é r i s a t i o n d e l ' h é m o g l o b i n e S inhibent par conséquence l a f a l c i f o r m a ti o n d'une part e t qu'en améliorant l e rapport F e 2 + / F e 3 + convertissent l a m é t h é m o g l o b i n e e n hémoglobine a u g m entant ainsi leur affinité pour l'oxygène e t donc l a réversibilité ( d é f a l c i f o r m a ti o n ) des h é m a t i e s f a l c i f o r m e s . Ceci justifierait par ailleurs l a superposition observée entre les courbes d e réversibilité d e l'extrait e t celles d e l a phénylalanine à certaines concentrations ( figure 1 1 ,1 2 ) .

L'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s a révélé les effets protecteurs d e l a membrane é r y t h r o c y t a i r e e n présence des agents inducteurs d e l ' h é m o l y s e . E n effet les résultats obtenus

d u test d e l'hémolyse induite par l'aspirine e n milieu hypotonique N a C l 0 ,4 5 % montrent une hémolyse maximale très significative ( P ? 0 ,0 5 ) d e 8 3 ,9 4 #177; 4 ,0 5 % à l a concentration d e 0 ,7

m g / m L d'aspirine c o m p a r a t i v e m e n t a u t é m o i n négatif ( sans aspirine). C e c i s e justifierait par l'effet oxydant d e l'aspirine qui à forte concentration e n t r a i n e l a production des radicaux libres attaquant l a membrane e t conduisant à s a p e r o x y d a t i o n lipidique avec pour conséquence l a lyse m e m b r a n a i r e e t libération d e l'hémoglobine ( H o u c h e r e t a l ., 2 0 0 1 ) . Cependant, l'étude d e l'effet inhibiteur d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l'aspirine 0 ,7 m g / m L montre que les deux concentrations, 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L d'extraits ont des activités a n t i h é m o ly t iq u e s très significatives ( P = 0 ,0 0 0 ) soit 9 6 % d ' i n h i b i t i o n . C e t t e forte activité serait due à l a présence des a n t i o x y d a n t e s e t a n t i r a d i c a l a i re s dans l a spiruline p r é c i s é m e n t s a richesse e n p o l y p h é n o l s ,

f l a v o n o ï d e s , p h y c o c y a n i n e , c a r o t é n o ï d e , vitam i n es e t minéraux antioxydants ( vitam ine E , sélénium, zinc) ( A m a e t a l ., 2 0 1 6 ) qui protégeraient l a membrane des hématies d e l a p e r o x y d a t i o n lipidique ( L e g e r , 2 0 0 0 ; P i n e r o e t a l ., 2 0 0 1 ) . C e taux d'hémolyse e n absence d e l'extrait ( 8 3 ,9 4 #177; 4 ,0 5 % ) est inférieur à celui d e H o u c h e r e t a l . ( 2 0 0 1 ) qui ont obtenu une hémolyse maximale d'environ 8 8 % avec une concentration 0 ,5 m g / m L d'acide salicylique pur

C o n c e r n a n t l ' h é m o l y s e induite par le peroxyde d ' h y d r o g è n e , l e s résultats m o n t r e n t q u e , par comparaison avec l e témoin n é g a t i f , u n e h é m o l y s e m a x i m a l e p l u s s i g n i f i c a t i v e ( P < 0 ,0 5 ) d e

8 2 ,2 1 #177; 4 ,2 5 % est obtenue à l a concentration 9 % d e peroxyde d'hydrogène e n absence d e

l'extrait e t d e l a q u e r c é t i n e ( standards). O n obtient m ê m e à une faible concentration d e 0 ,2 % d e peroxyde d'hydrogène u n taux d ' h é m o l y s e d e 4 3 ,3 7 #177; 6 ,2 7 % . Ces forts taux d ' h é m o l y s e m ê m e à faibles concentrations d e peroxyde d'hydrogène serait d û a u f a i t q u e l e peroxyde d'hydrogène

e n t r a i n e des dommages o x y d a t i f s destructeurs d e l a membrane cytoplasm i q u e suite à l a p e r o x y d a t i o n lipidique des acides gras p o l y i n s a t u r é s présents dans celle-ci ( Singh e t R a j i n i , 2 0 0 8 ) . E n e f f e t , l o r s q u e l e H ₂ O ₂ t r a v e r s e l a m e m b r a n e p l a s m i q u e , i l p e u t c a u s e r l a dégradation

d e l ' h è m e d e l ' h é m o g l o b i n e p a r o x y d a t i o n d e s i o n s F e e n F e , avec production des radicaux

hydroxyles ( H O ° ) qui sont très instables e t très réactifs par la réaction d e Fenton. Ces radicaux induisent une c h a i n e d e p e r o x y d a t i o n lipidique aboutissant à l a lyse des hématies ( O k o k o e t Ere, 2 0 1 2 ) . L'extrait d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s a révélé u n effet protecteur contre l ' h é m o l y s e induite par l e peroxyde d'hydrogène. D e plus, plusieurs études ont prouvé que certains des

c o m posés p h é n o l i q u e s , n o tam m e n t l e s flav o n o ïdes possèdent des propriétés a n t i r a d i c alaires, e n neutralisant o u e n piégeant les radicaux libres ( H a t i a e t a l ., 2 0 1 4 ) . E n outre, les p o l y p h é n o ls

s o n t c o n n u s c o m m e c h é l a t e u r s d e m é t a u x d e t r a n s i t i o n t e l s q u e l e F e , r é d u i s a n t a i n s i l a vitesse

d e réaction d e Fenton par transfère d'électrons. Ils peuvent aussi empêcher les oxydations causées par l e radical hydroxyle ( T s a o , 2 0 1 0 ) e t empêcher l e passage d e H ₂ O ₂ à travers l a membrane é r y t h r o c y t a i r e e t l a génération des radicaux libres ( H a p n e r e t a l ., 2 0 1 0 ) . A u cours d e cette étude, nous avons obtenu u n taux maximal d'inhibition d e 3 6 ,7 6 #177; 1 ,2 7 % avec l a concentration 1 6 0 0 u g / m L d'extrait d e spiruline. C e taux est inférieur à celui obtenu par C h a k r a b o r t y e t Shah. ( 2 0 1 1 ) ( 4 0 ,6 % ) avec 5 0 0 0 u g / m L d ' e x t r a i t d e feuilles d e Fiber betel, inférieur à 5 4 % pour l'extrait d e A c a l y p h a indica à 2 0 0 0 0 u g / m L ( K a d a l i e t a l ., 2 0 1 6 ) . E t supérieur à 1 5 ,7 0 #177; 0 .5 3 % obtenu par O k o k o e t Ere. ( 2 0 1 2 ) avec 2 0 0 0 u g / m L d ' e x t r a i t b r u t d e C a r i c a papaya L a différence d ' e f f e t i n h i b i t e u r e n t r e l a concentration 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g /m L s'expliquerait par l e fait que l e H ₂ O ₂ est u n puissant pro-oxydant e t nécessite d e forte concentration d ' a n t i o x y d a n t p o u r s a neutralisation ( M ilane e t a l . , 2 0 0 4 ) .

Les résultats d e l'hémolyse induite par l e triton X - 1 0 0 à différentes concentrations d u détergent montrent une h é m o l y s e significative ( p < 0 ,0 5 ) entre l'effet d u triton X - 1 0 0 aux c o n c e n t r a t i o n s u t i l i s é e s e t l e contrôle n é g a t i f p o u r l e q u e l l e triton est remplacé par l e PBS. A l a concentration 1 % d e d é t e r g e a n t i l y a une hémolyse maximale e t significative à ( P = 0 ,0 0 ) avec u n taux d e 1 0 0 % , c e résultat corrobore celui d e P r e t é e t a l . ( 2 0 1 1 ) qui ont obtenu 1 0 0 % hémolyse à l a concentration 1 M m d e triton X - 1 0 0 . Cette hémolyse totale serait due à l a nature chimique due triton X - 1 0 0 . E n e f f e t l e triton X - 1 0 0 a l a capacité d e p e r t u r b e r l a membrane des

globules rouges e t des cellules e n général. C'est u n détergent d e synthèse non ionique qui est constituée d'une partie polaire hydrophile e t d'une queue h y d r o p h o b e . L e s m o l é c u l e s d u triton X - 1 0 0 entrent e n interaction avec les parties hydrophobes des lipides d e l a membrane é r y t h r o c y t a i r e j u s q u ' à saturation, c e q u i p r o v o q u e l'extraction des lipides e t p u i s l a perturbation

d e l'organisation d e l a m e m b r a n e . A des concentrations très élevée, les globules rouges seront totalement solubilisés sous forme d e micelles o u d e liposomes ( M u t h u e t durais, 2 0 1 5 ) . Cependant, l'étude des propriétés a n t i h é m o l y t i q u e s d e l'extrait sur l'effet d u triton X - 1 0 0 à l a concentration 1 % , m o n t r e que l ' e x t r a i t e t l a q u e r c é t i n e o n t d e s activités inhibitrices d ' h é m o ly s e très p r o n o n c é e s . E n e f f e t , l ' a n a l y s e statistique d e comparaison d u pourcentage d'hémolyse d u t é m o i n négatif sans l'extrait e t sans l a q u e r c é t i n e à ceux d e l'extrait e t d u standard ( q u e r c é tine) à l a 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L montre qu'à l a concentration 8 0 0 u g / m L , seul l'extrait inhibe s i g n i f i c a t i v e m e n t ( P = 0 ,0 3 0 ) l ' h é m o ly s e induite par l e triton 1 % . E n revanche, à l a concentration 1 6 0 0 u g / m L , l'extrait e t l a q u e r c é t i n e inhibent significativement ( P < 0 ,0 5 ) l ' h é m o l y s e . Ceci montre q u ' i l y a une corrélation positive entre l a concentration e t l ' a c t i v é inhibitrice d e l'extrait

e t d u standard s u r l ' h é m o l y s e i n d u i t e p a r l e triton X - 1 0 0 à 1 % : p l u s l a concentration e s t g r a n d e plus grand est l e taux d'inhibition d e l ' h é m o l y s e . L e taux maximal d'inhibition 4 5 ,9 5 #177; 1 0 ,7 1 % obtenu pour l a concentration 1 6 0 0 u g / m L avec l'extrait d e spiruline sera alloué à l a capacité des p o l y p h é n o l s d e l'extraits d e spiruline d ' i n t e r a g i r a v e c les pôles polaires externe d e l a b i c o u c h e lipidique e t empêcher leur solubilisation par le d é t e r g e n t e t donc prévenir l'hémolyse o u alors leur capacité à recouvrir l a membrane e t empêcher l e triton d e s'infiltrer dans l a b i c o u c h e lipidique e t par conséquent empêcher l a solubilité m e m b r a n a i r e . C e taux est supérieur à 1 4 ,9 7 #177; 0 ,1 5 % obtenu par A m r a n e e t A o u a r t i l a n e . ( 2 0 1 8 ) à une concentration d e 1 5 0 0 u g / m L avec les extraits des feuilles d ' E c b a l l i u m e l a t e r i u m .

L'étude d e l'hémolyse induite par l a solution hypotonique sur les hématies d r é p a n o c y t a i r e s m o n t r e que l e maximum d'hémolyse a été obtenu à l a concentration 0 ,3 5 % d e N a C l avec u n taux d'hémolyse d e 7 8 ,0 5 #177; 8 ,1 0 % . I l ressort qu'il y a une corrélation négative entre l a concentration e n sels e t l e pourcentage d ' h é m o l y s e : plus l e milieu est concentré e n N a C l plus l e taux d'hémolyse des globules diminue. E n effet l'activité hémolytique l a plus élevée est observée dans l e milieu l e moins concentré, Nos résultats corroborent ceux d e N k e n m e n i e t a l . ( 2 0 1 9 ) qui ont obtenu e n absence d e l'extrait une hémolyse hypotonique d e 8 0 % ; 1 6 % pour les concentrations d e N a C l 0 ,3 5 % e t 0 ,8 5 % respectivement. Ceci s e justifie par l e fait que dans l e milieu isotonique les concentrations e x t r a c e l l u l a ir e s s o n t p r e s q u e égales à celles intracellulaires ; dans cette condition, i l y a pratiquement équilibre d e pression

osmotique entre les deux milieux. Par contre, dans l e milieu hypotonique l a concentration e x t r a c e l l u l a i re est faible par rapport à celle intracellulaire e t i l y a déséquilibre d e l a pression o s m o t i q u e . I l e n résulte une pénétration d e l'eau dans l a cellule afin d ' é t a b l i r l ' é q u i l i b r e . C e t t e pénétration progressive f i n i t p a r l y s é l a membrane cellulaire au-delà d'un certain seuil. Dans notre étude, les résultats d e l'évaluation d e l'activité d'inhibition d e l'extrait e t q u e r c é t i n e sur l'hémolyse induite par l a solution hypotonique N a C l 0 ,3 5 % montre que les concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L d'extrait e t d e q u e r c é t i n e inhibent s i g n i f i c a ti v e m e n t l ' h é m o l y s e . L e s taux d'inhibitions suivants ont été obtenu pour les concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L d ' e x t r a i t 8 0 #177; 8 ,6 6 % ; 7 1 ,2 5 % r e s p e c t i v e m e n t . N o s r é s u l t a t s s o n t s i m i l a ir e s à 7 6 ,6 6 % o b t e n u p a r A m r a n e e t A o u a r t i l a n e . ( 2 0 1 8 ) avec l'extrait d ' E c b a l l i u m e l a t e r i u m à l a concentration d e 1 0 0 0 u g / m L . L ' e f f e t a n t i h é m o l y t i q u e d e l ' e x t r a i t d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l'hémolyse induite par la solution hypotonique pourrait être soit attribué à s a richesse e n sels minéraux A m a e t a l . ( 2 0 1 6 ) qui é t a b l i t l ' é q u i l i b r e d e concentration e t d e pression o s m o t i q u e , s o i t à s a capacité d e s e fixer sur l ' a q u a p o r i n e e t e m p ê c h e r l ' e a u d'entrer dans l'hématie ( L o u e r r a d e t a l ., 2 0 1 6 ) .

Evaluation in vitro des propriétés antifalcémiantes et antihémolytiques de l'extrait aqueux de spirulina platensis (oscillatoriaceae) du Cameroun

CHAPITRE III : R É S U L T A T S E T DISCUS S I O N