II.4.2.2. Séparation des produits
amplifiés par électrophorèse sur gel d'agarose
Principe de la technique : Elle est
basée sur la séparation des acides nucléiques
chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique.
Cette séparation s'effectue à travers une matrice (agarose dans
ce cas): les molécules de petites tailles se déplaceront plus
rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles
supérieures.
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Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
La séparation des produits amplifiés sur gel
d'agarose a été faite dans le but de vérifier si les
réactions d'amplifications étaient bonnes. Pour cela, nous avons
préparé un gel d'agarose à 2% par un mélange de 2g
d'agarose et 100 ml de tampon (Tris-Borate-EDTA) TBE 0,5X (annexe 1). Le
mélange a été porté à ébullition dans
un four à micro-ondes pendant 3 minutes. Après refroidissement,
3ìl de Bromure d'Ethidium (BET) ont été ajoutés et
l'ensemble a été versé dans un moule. A refroidissement et
solidification du gel, le peigne a été enlevé. Par la
suite, 6ul des produits d'amplification ont été
mélangés à 2ul de bleu de charge. Le mélange a
été déposé dans les puits du gel et la
séparation a été faite à 100 volts pendant 30
minutes dans le tampon TBE 0,5X (Tris-Borate-EDTA). La révélation
a été faite par observation du gel sur un trans-illuminateur
à UV. Les échantillons ayant présenté des bandes
d'ADN ont été sélectionnés dans le but de
déterminer le nombre et la taille des allèles sur un gel de
polyacrylamide.
II.4.2.3. Séparation des allèles sur gel
de polyacrylamide
Les amplicons ou produits de la PCR ont été
séparés sur gel d'acrylamide afin d'observer le polymorphisme
génétique qui se reflète par le polymorphisme de longueur
des séquences microsatellites amplifiées. A cet effet, la
résolution des produits d'amplification s'est faite sur gel de
polyacrylamide à 10% (seuls les échantillons qui ont
présenté une bande sur gel d'agarose ont été
sélectionnés). Pour ce faire, le gel de polyacrylamide a
été préparé en mélangeant : 18,33 ml
d'acrylamide/bis acrylamide (19:1) à 30%, 5,5 ml de Tris Borate EDTA
(TBE) 10X, 30,62 ml d'eau distillée, 481,25 ul d'APS (10%) et 68,75 ul
de TEMED. Le mélange a été introduit dans le moule
vertical d'électrophorèse avec un peigne pour former les puits.
Après polymérisation du gel (environ 30 minutes), le peigne a
été enlevé et les puits ont été lavés
avec le tampon de migration Tris Borate EDTA (TBE) 1X. Par la suite, 19ul de
chaque produit d'amplification ont été mélangés
à 3ul de bleu de charge. Les mélanges ont été
introduits dans les puits du gel préalablement nettoyés. A
côté des échantillons, 7ul de marqueur de poids
moléculaire ont été introduits dans un autre puits pour
l'estimation de la taille des allèles. La migration s'est faite dans du
tampon TBE 1X à 150 Volts pendant environ 17 heures. A la fin de la
migration, le gel a été coloré dans un bain de bromure
d'éthidium (30 ul de bromure d'éthidium pour environ 600 ml de
tampon TBE 1X). L'ensemble a été incubé pendant 20 minutes
à l'abri de la lumière. Par la suite, le gel a été
lavé à l'eau afin d'éliminer l'excès de bromure
d'éthidium. Le gel a été enfin visualisé sous UV,
puis photographié.
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Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
Etant donné que les mouches tsé-tsé sont
des organismes diploïdes, on s'attend après résolution des
produits d'amplification à deux bandes (2 allèles) pour un
individu hétérozygote pour le locus analysé et une bande
pour un individu homozygote. A la fin de chaque électrophorèse,
la taille de chaque allèle a été estimée à
partir des marqueurs de poids moléculaire (PM) en traçant la
courbe du logarithme décimal du poids moléculaire en fonction de
la distance de migration (D) (log PM =f (D)).
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