II.4.2. Identification moléculaire de G. p.
pallicera
Pour confirmer l'appartenance taxonomique issue des
critères morphologiques, nous avons amplifié l'ITS1 (internal
transcribed spacer 1) de tous les échantillons qui ont
été retenus pour cette étude. En effet, des amorces
consensus ont été mises au point et permettent d'amplifier l'ITS1
de toutes les espèces et sous espèces de mouches
tsétsé. Une fois que l'ITS1 est amplifié, l'identification
des différentes espèces se fait à partir du polymorphisme
de longueur qui s'observe entre les différentes espèces de
glossines.
L'identification moléculaire de G. p. pallicera
a été faite suivant la méthode décrite par
Dyer et al. (2008) en utilisant le couple d'amorces Diag forward
(5'TGGACTTCGGATTAAGTACAACA-3') et Diag
reverse
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Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
(5'TCATTATGCGCTATTAAGGTAAGC-3'). Les réactions
d'amplification ont été faites dans un milieu réactionnel
de 25ul contenant 2,5ul de tampon PCR 10X (10 mM Tris-HCl ; 50 mM KCl; 1,5 mM
de MgCl2), 10 pmoles de chaque amorce, 200 uM de dNTPs; 5U de Taq ADN
polymérase et 2,5 ul d'extrait d'ADN dilué au 10eme.
Les amplifications ont été réalisées dans un
thermocycleur de marque TECHNE selon le programme suivant : une étape de
dénaturation initiale à 950C pendant 3 minutes, suivie
de 30 cycles d'amplification comprenant chacun une étape de
dénaturation à 950C pendant 30 secondes, une
étape d'hybridation des amorces à 560C pendant 30
secondes, et une étape d'élongation à 720C
pendant 1 minute. A la fin, une extension finale a été
réalisée à 720C pendant 5 minutes. Les produits
d'amplification ont été séparés sur gel d'agarose
à 2% en vue de distinguer différentes espèces de
glossines.
II.4.2.1. Amplification des loci microsatellites des
glossines
Pour cette étude, nous avons analysé neuf loci
microsatellites ; B3, B104, C102, B110 et A10 de ROBINSON (FAO/IAEA), Gpg55.3
de Solano et al. (1997), Pgp13 et Pgp24 de Luna et al. (2001)
et GpCAG133 de Baker et Krafsur (2001). Chaque locus microsatellite a
été amplifié en utilisant les amorces dont les
séquences sont contenues dans le tableau 1. Les réactions
d'amplifications ont été faites dans un milieu réactionnel
de 25ul contenant 2,5ul de tampon PCR 10X (10 mM Tris-HCl ; 50 mM KCl; 1,5 mM
de MgCl2), 10 pmoles de chaque amorce, 200 uM de dNTPs, 5U de Taq ADN
polymérase et 5 ul d'extrait d'ADN. Le programme d'amplification
contenait une étape de dénaturation initiale à
950C pendant 5 minutes et 40 cycles d'amplification comprenant
chacun une étape de dénaturation à 950C pendant
30 secondes, une étape d'hybridation des amorces pendant 30 secondes
à des températures variables (voir tableau 1) en fonction du
couple d'amorces utilisées, une étape d'élongation
à 720C pendant 1minute. Une extension finale a
été réalisée à 720C pendant 10
minutes.
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Caractérisation génétique de Glossina
pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de
Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE
Emmanuel Boris
Tableau 1: Séquences et températures
d'hybridation des amorces utilisées pour le
|
génotypage
|
|
|
|
|
Caractéristique
Marqueurs
|
Séquence de l'amorce
5' 3'
|
Motif du
microsatellite
|
Température d'hybridation
|
Références
|
|
55.3
|
F:5'GTACTCAACGTGGTGCTTAAAGTTG3' R: 5'
GTCTGAGATAGGACCATTTATCG3'
|
(GT)GC(GT)
|
51,0
|
Robinson (FAO/IAEA)
|
|
Pgp13
|
F:5'AAAATAACGAACGGGTGCAG3'
R: 5' GACGCACGCACATAGTTACG3'
|
(GT)TT(GT)
|
54,5
|
Luna et al.,
2001
|
|
Pgp24
|
F:5'AATTCCCGCCGGTAAAGTT3'
R: 5' TGTTTGCGTATGCATCTGTG3'
|
(TA)CA(TA) T (GT)
|
53,5
|
Luna et al.,
2001
|
|
C102
|
F:5'CGTTAAATTGTCACGATGAAG3' R:5'AGCACATTTTTGGTACATTTATACC3'
|
(TGA)
|
52,0
|
Robinson (FAO/IAEA)
|
|
GpCAG133
|
F:5'ATTTTTGCGTCAACGTGA 3'
R: 5' ATGAGGATGTTGTCCAGTTT 3'
|
(CAG)
|
50,0
|
Baker et
Krafsur
(2000)
|
|
B104
|
F:5'ACGATTGTTCTTCTTCATTCC3' R:5'AAGAAGCCAAACTTTCAACGCTCGC3'
|
(GA)
|
52,0
|
Robinson (FAO/IAEA)
|
|
B3
|
F:5'TTCGCTTTTGTCAGAAGTG3'
R: 5' TCCCAGACGGTTXATATTAC3'
|
(GA)
|
56,0
|
Robinson (FAO/IAEA)
|
|
B110
|
F:5'ATAGATCGGCTAAATCCATGTAG3'
R:
5'TTTATTGCTTGTAGTGGTGAGAG3'
|
(GA)
|
51,5
|
Robinson (FAO/IAEA)
|
|
A10
|
|
|
56,0
|
Robinson (FAO/IAEA)
|
| 
