Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

UNIVERSITE DE RENNES I (U.F.R. Sciences de la vie et de l'Environnement)

ECOLE NATIONALE D'INGENIEURS DES TECHNIQUES DES INDUSTRIES AGRICOLES ET ALIMENTAIRES DE NANTES (ENITIAA)

MASTER SCIENCES, TECHNOLOGIES, SANTE : mention Recherche en Biologie

Spécialité : Microbiologie Fondamentale et Appliquée

2005/2006

Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

Mémoire présenté le 27 juin 2006

Par

Ziad RIZK

Stage effectué au Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle de l'ENITIAA de Nantes

MASTER SCIENCES, TECHNOLOGIES, SANTE : mention Recherche en Biologie

Spécialité : Microbiologie Fondamentale et Appliquée

2005/2006

Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

Mémoire présenté le 27 juin 2006

Par

Ziad RIZK

Maître du stage :

Xavier DOUSSET -Professeur

Bernard ONNO- Maître de conférence

Stage réalisé au Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle de l'ENITIAA de Nantes

Début du stage : 5/Janvier/ 2006

Fin du stage : 25/Juin/2006

REMERCIEMENTS

Je tiens tout d'abord à remercier Monsieur le Professeur Hervé PREVOST, responsable du laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle (LMAI) de l'ENITIAA, de m'avoir accueilli au sein de son unité.

Je tiens à remercier Monsieur le Professeur Xavier DOUSSET pour son encadrement scientifique et les conseils prodigués tout au long de mon stage.

Je remercie également Monsieur Bernard ONNO pour son encadrement scientifique, sa persévérance et sa contribution à la réalisation de ce travail.

J'adresse ma vive reconnaissance à Angélique FOURRIER « Technicienne » du laboratoire pour m'avoir, initié aux techniques de biologie moléculaire et pour ses précieuses valeurs humaines. Je la remercie également pour sa patience, sa bonne humeur et sa joie de vivre.

J'exprime ma gratitude à Maria IGNATOVA et à Zouheir BEN BELGACHEM « Thésards » à l'ENITIAA pour leur collaboration et leur disponibilité au cours de ce travail.

Je remercie conjointement tous les stagiaires et thésards du laboratoire en particulier : Morgan, Ségolène, Emmanuel, Sébastien et Stella pour leur conseils et surtout pour leur accueil qui a rendu mon séjour très agréable à l'ENITIAA.

Enfin, je n'oublie pas de remercier les enseignants chercheurs ainsi que le personnel du laboratoire pour leur soutien, leur disponibilité et leur gentillesse.

ABREVIATIONS

BET : Bromure d'éthidium

BSA : Bovine Sérum Albumine

DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

EDTA : Ethyl Diamine Tétracide Acétique

ISR : Intergenic Spacer Region

ITS : Internal Transcribed Spacer

Lb : Lactobacillus

Ln : Leuconostoc

MRS: Man Rogosa Sharpe

RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

S: Svedberg

SDB: SourDough Bacteria

SDS: Sodium Dodécyl Sulfate

TAE: Tris Acétate EDTA

TBE : Tris base EDTA

TGGE : Temperature Gradient Gel Electrophoresis

TTGE : Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis

UFC : unité formant colonie

Wt/v: Weight per volume

V/V : volume par volume

SOMMAIRE

Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques de levains de panification

Introduction bibliographique

Chapitre I- Etude bibliographique

I. Généralités 1

II. Définition d'un levain de panification 1

III. Les microorganismes des levains de panification 1

III.1. Les levures 1

III.2. Les bactéries lactiques 3

III.3. Les principaux rôles des bactéries lactiques en panification 4

III.3.1. Le rôle protéolytique des bactéries 4

III.3.2. La production du gaz carbonique 4

III.3.3. Les aspects aromatiques 5

III.3.4. L'activité anti-microbienne 5

IV. Les méthodes de caractérisation moléculaire des bactéries lactiques 5

Chapitre II- Matériels et Méthodes

I. Souches de référence 11

II. Echantillons des levains étudiés 11

III. Détermination du pH et du TTA 11

IV. Milieux de culture 11

IV.1. Milieux de dénombrement des levures 11

IV.2. Milieux de dénombrement, d'isolement et d'identification des bactéries 12

lactiques

IV.3. Conservation des souches et des isolats 12

V. Dénombrement et isolement des bactéries lactiques 12

VI. Caractérisation des bactéries lactiques 12

VI.1.Caractérisation phénotypique 12

1- La morphologie des colonies et la coloration de Gram 12

2- Le test de catalase 12

3- Le test homo/hétérofermentaire 12

VI.2.Caractérisation moléculaire 12

1- Extraction de l'ADN selon le Kit Qiagen 12

2- Quantification de l'ADN 13

3- Les amorces 13

4- La PCR 13

5- L'électrophorèse sur le gel d'agarose 14

6- La restriction enzymatique (RFLP) 15

Chapitre III- Résultats et Discussions

I. Détermination du pH et du TTA 16

II. Identification des bactéries lactiques du levain Français 16

II.1. Dénombrement des bactéries lactiques et des levures  16

II.2. Identification phénotypique des bactéries lactiques  17

II.3. Identification moléculaire des bactéries lactiques  17

II.3.1. Identification des isolats du BF-70  17

II.3.2. Identification des isolats du BF-FC  21

II.3.3.PCR sur colonies 22

Conclusions et perspectives 24

Références bibliographiques 26

Tableaux et figures 29

INTRODUCTION

Le pain est un aliment de base dans de nombreuses sociétés humaines. Il est fabriqué à partir de farine, de levure ou levain et d'eau. Ce qui caractérise le pain, c'est le fait que la pâte est soumise à un gonflement dû à la fermentation. La farine provient principalement de céréales panifiables : blé et seigle. En effet, celle-ci se caractérise par la présence d'une protéine, le gluten, qui emprisonne les bulles de gaz carbonique dégagées par la fermentation et permet la levée de la pâte.

Le premier pain produit par l'humanité était vraisemblablement un pain au levain résultat d'une fermentation mixte levures-bactéries lactiques. Ce procédé traditionnel de panification s'est perpétué jusqu'à ce jour, malgré la place prépondérante occupée par la levure de boulangerie.

Les industries des produits céréaliers fermentés (panification, viennoiserie, crackers, boissons aux céréales) ont actuellement un regain d'intérêt pour les fermentations mixtes-bactéries lactiques, sur le modèle levain naturel dans le but d'améliorer les qualités aromatiques, organoleptiques, nutritionnelles et bioconservatrices des aliments.

La maîtrise de ce procédé de fermentation mixte s'appuie d'une part sur l'étude de la biodiversité microbienne des levains et d'autre part sur la caractérisation des flores, notamment, lactiques à l'aide de méthodes d'identification biomoléculaires.

La région intergénique ITS qui sépare les gènes ribosomiques codant pour l'ARNr 16S et 23S de l'opéron ribosomique met en évidence un polymorphisme de taille et de séquence suffisant pour permettre l'identification et la différenciation des genres, des espèces bactériennes et éventuellement des souches d'une même espèce.

Ce projet a d'abord pour objectif : d'une part de montrer l'influence de la matière première mise en oeuvre sur la flore lactique d'un levain et notamment sur la diversité des espèces de Lactobacillus et d'autre part de valider les méthodes moléculaires de caractérisation des flores lactiques par amplification et restriction enzymatique des régions intergéniques 16S-23S sur des échantillons de levains.

Ces études concernant la caractérisation moléculaire des levains de panification se réalisent au sein du laboratoire de Microbiologie alimentaire et industrielle de l'Ecole Nationale d'Ingénieurs des Techniques des Industries Agricoles et Alimentaires (ENIT IAA) à Nantes.

I. Généralités

Quatrième producteur de blé au monde, la France est un pays de tradition boulangère. Pourtant la consommation de pain en France n'a cessé de chuter depuis la moitié du 20^ème siècle. Les modifications du mode de vie et le développement des techniques de réfrigération favorisant la consommation d'autres aliments peuvent expliquer cette baisse de popularité.

Dans ce contexte, des efforts sont entrepris, notamment par le secteur artisanal, pour améliorer la qualité des produits et pour diversifier l'offre. Les fermentations longues sont un des moyens pour atteindre cet objectif. La fermentation au levain pourrait, dans ce cadre, connaître un nouvel essor du fait des caractéristiques organoleptiques des produits obtenus par ce procédé.