Les échantillons de poisson congelé ont
été prélevés dans les congélateurs des
poissonneries. Chaque poisson sera introduit dans des sachets stériles
puis dans des glacières prévues à cet effet pour assurer
leur transport jusqu'au laboratoire. Une fois au laboratoire, une fraction de
chair a été prélevée sur chacun des poissons,
laquelle a été par la suite utilisée pour la
préparation de la solution mère nécessaire à
l'isolement et au dénombrement des colonies.
La protection du prélèvement Il
faut éviter :
- d'une part, la contamination par d'autres germes,
d'où la nécessité de travailler dans des conditions
aseptiques,
- d'autre part, la pullulation des germes qui s'y trouvent.
? Solution mère et dilution décimale (NF
V08 - 010 - Mars 1996).
La préparation de la solution mère consiste
à prélever aseptiquement 5 grammes de produit et à les
introduire dans un StomacherND 45 ml d'eau peptonée
tamponnée (EPT) sont
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ensuite ajoutés au contenu du sachet pour obtenir la
solution mère -(SM). L'homogénéisation du contenu du
sachet se fait pendant 3 mn au StomacherND, puis la
solution est récupérée dans un flacon avec fermeture ou
dans des sachets stériles. Cette suspension contenant des
microorganismes est laissée au repos pendant 30 mn pour assurer leur
revivification. Le titre de cette solution mère est obtenu en
établissant le rapport :
Poids de l'aliment
Volume total (diluant +
aliment)
Par ailleurs, pour les aliments liquides, on considère
que leur densité est proche de 1, et par conséquent 1 gramme
d'aliment équivaut à un volume de 1 millilitre. A partir de la
solution mère, des plus petites dilutions sont réalisées
pour faciliter les dénombrements.
? Dénombrement des micro-organismes
aérobies à 30°C (Norme ISO 4833 : Février
2003)
On prélève 1 ml de chaque dilution
(10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5) qu'on introduit aseptiquement dans les boîtes de
Pétri à usage unique. On y ajoute 15 ml de milieu PCA (Plate
Count Agar) fondu et refroidi au bain marie à 45°C. Le
mélange est homogénéisé par des mouvements
circulaires des boites. Après solidification, 5 ml de PCA est
ajouté. Cette deuxième couche permet d'éviter
l'envahissement de la boîte par les germes pouvant rendre difficile la
lecture. Les boîtes sont ensuite incubées à 30°C. Le
comptage se fait après 72 heures d'incubation. Les colonies
caractéristiques apparaissent blanchâtres.
? Dénombrement des coliformes thermo
tolérants ou « fécaux» (NF V 08 - 060 - Mars
1996)
Le milieu utilisé pour l'isolement par la
méthode de double couche est la gélose au désoxycholate
à 1%. En effet, 1ml des dilutions 10-1 et 10-2 est
introduit dans les boîtes de Pétri à usage unique. On y
coule deux couches de désoxycholate à 1%. Après incubation
de 24h à 48h, les colonies de coliformes fécaux apparaissent
rouges foncées sur un fond rouge. Seules les colonies de
diamètres supérieurs à 0,5 mm sont
dénombrées.
? Dénombrement des staphylocoques
pathogènes (NF V 08 - 014 - Janvier 1984)
Ce sont des bactéries en cocci, à gram positif
qui possèdent une catalase et sont aéro-anaérobies
facultatives. Cette dernière caractéristique les
différencie des microcoques qui appartiennent également à
la même famille et qui sont aérobies strictes. Staphylococcus
aureus possède l'aptitude d'élaborer des
entérotoxines qui provoquent des intoxinations
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alimentaires se traduisant entre autres par des vomissements
incoercibles, des crampes abdominales et en diarrhée. Donc, la
présence de Staphylococcus aureus en nombre
élevé
peut conduire à l'accumulation de suffisamment de toxine
pour induire une intoxination alimentaire.
- Mode opératoire
Le milieu Mannitol Salt Agar est coulé en boîte de
pétri. Après solidification, il est ensemencé en surface
avec 0,1 ml de la solution mère. L'inoculum est ensuite
étalé à l'aide d'un étaleur en verre ou en
plastique. L'incubation se fait à 37°C pendant 48h.
- Lecture
Les colonies de Staphylococcus aureus apparaissent sur
le milieu, noires, bombées, rondes et entourées d'un halo
d'éclaircissement.
- Test de confirmation Test de la coagulase
Prélever un nombre représentatif de chaque type
morphologique de colonies caractéristiques et en incuber des tubes de
bouillon coeur- cervelle (BCC). Il s'agit d'un milieu de culture riche qui sert
également à la recherche de la thermonucléase.
Incuber à 35°C pendant 12 à 24h.
Mélanger ensuite dans un tube à hémolyse stérile
0,2ml de la culture obtenue avec 0,3ml de plasma de lapin. Incuber à
37°C. La réaction est positive lorsque le plasma est coagulé
et lorsqu'on peut retourner le tube même si cela s'accompagne d'un
léger écoulement. Des réactions faiblement positives
peuvent être obtenues.
? Recherche et dénombrement des salmonelles
(norme ISO6579/A1 : juillet 2007)
La recherche et le dénombrement de salmonelle font
appel à plusieurs milieux de culture (milieux Rappaport,
Sélénite cystine, hecktoen, gélose nutritive, galerie API
20 E ) et se déroulent en plusieurs étapes.
? Pré enrichissement
La solution mère de dilution 10-1 est
incubée pendant 20 heures à une température de 20°C.
? Enrichissement sélectif
Après cette première étape, 0,1ml et 2
ml de la solution mère sont prélevés et introduits dans
deux tubes à essai contenant respectivement 10 ml de rappaportde
Vassiliadis
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(RV) et 20 ml de sélénite cystine. Les tubes sont
ensuite incubés pendant 24 heures à 42°C (tube du rappaport)
et à 37°C (tube de sélénite cystine).
? Isolement
Les cultures sur rappaport et sélénite cystine
sont ensemencées séparément dans des boîtes de
Pétri stériles dans lesquelles on a préalablement
coulé le milieu hecktoen qui s'est solidifié. Les boîtes
ainsi ensemencées sont incubées pendant 24h à 48 heures
à 37°C.
? Identification et Purification
Les colonies caractéristiques sont isolées sur
gélose nutritive puis mises en cultures à 37°C pendant 24
heures.
? Test biochimique
Une colonie de la gélose nutritive est
ensemencée sur la galerie API 20 E. Après 24 heures d'incubation
à 37°C, la galerie est lue.
Expression des résultats :
Pour avoir le niveau de contamination en germes par gramme de
produit, on utilise la formule suivante.
Ó colonies
N=
Vml. X (n1+ 0,1 n2) X d1
Ou :
N : nombre d'UFC par gramme de produit initial
;
Ó Colonies : Somme des colonies de
boites interprétables (germes/g); Vml : Volume de la
solution déposé (ml)
n1 : Nombre de boites considérées
à la première dilution retenue ;
n2 : nombre de boites considérées
à la seconde dilution retenue ;
d1 : Facteur de la première dilution
retenue.
Cette formule est valable pour tous les dénombrements des
germes précédents. 1.5.2- Méthode
d'interprétation des résultats
L'interprétation des résultats se fera suivant un
plan à 3 classes en tenant compte des critères suivants :
? Un échantillon est qualifié de qualité
microbiologique satisfaisante (QMS) si la flore F est comprise entre 0 et m
;
? De qualité microbiologique acceptable (QMA) si la
flore (F) est comprise entre m et 3m ;
? De qualité microbiologique non Conforme (QMNC) si F
est comprise entre 3 m et 10 m. m étant le critère
microbiologique du tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5 : Critères microbiologiques
relatifs aux poissons congelés, frais et fumés destinés
à la consommation humaine
