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Les éléments transposables: le cas du transposon mariner une approche expérimentale( Télécharger le fichier original )par R Ferhi Université de Tebessa - DES en Biochimie et Biologie moléculaire 2009 |
III.1.1.3. La réinsertion de l'élément dans son site cible :Au cours de cette étape le transposon est transféré par la transposase dans un site accepteur du génome hôte. Ce site est caractérisé par la présence d'un dinucléotide TA dupliqué lors de l'insertion, les mécanismes moléculaires intervenants pendant cette étapes sont encore inconnus. (In Halaimia Toumi, 2006). III.1.2. L'intérêt de l'étude des MLEs : Mariner est le parasite génétique le plus ubiquiste connu chez les eucaryotes, cette propriété explique l'intérêt fondamental de l'étude des MLEs ainsi que les perspectives de valorisation biotechnologique et médicale d'un tel modèle biologique. III.1.2.1. L'intérêt fondamental :Les MLEs peuvent jouer un rôle dans la plasticité des génomes hôtes, en favorisant les réarrangements chromosomiques par exemple : chez la drosophile les changements de place des transposons étaient essentiellement associés à des réarrangements chromosomiques qu'à de la transposition. Sous cette hypothèse, toutes les copies même inactives participent majoritairement dans l'évolution des génomes. Présents dans de nombreux génomes eucaryotes et souvent avec un nombre élevé de copies en grande partie inactive, les MLEs pourraient être des acteurs importants de la plasticité des génomes eucaryotes. La présence des copies active favorise et renforce leur impact sur les génomes en affectant directement la régulation de l'expression des gènes comme dans le cas de Dmmar1. Un exemple du rôle possible des MLEs dans la recombinaison a d'autre part été illustré dans le génome humain par : la maladie de Charcot-Marie Tooth qui est due à un crossing-over inégal sur le chromosome 17p, un élément mariner a été identifié à proximité du point de recombinaison et les auteurs suggèrent que la recombinaison pourrait avoir été favorisé par une cassure de l'ADN due à la transposase. Il semble que les éléments mariner aient, ou ont eu, la capacité de se perpétuer en colonisant de nouveaux génomes, suite à des transferts horizontaux, alors les MLEs pourraient jouer un rôle dans l'évolution des génomes. III.1.2.2. L'intérêt appliqué :Grâce à leurs ubiquité et activité, les éléments mariner offrent les bases intéressants d'un vecteur de transfert d'ADN. Une transposase hyperactive dérivée de l'élément Himar1 a été obtenue par ingénierie moléculaire, démontrant qu'il est possible d'améliorer les MLEs naturels peu efficaces en transposition. Ainsi de nombreuses publications décrivant l'obtention, grâce à mariner des organismes ou de lignée de cellules transgéniques chez les protozoaires, les insectes, les poissons et les oiseaux confirment que mariner est un bon candidat pour transférer l'ADN exogène chez les eucaryotes (In Augé Gouillou, 2003 ; in Halaimia Toumi, 2006). Par exemple chez la souris, il est possible de transfecter des cellules souches avec un élément mariner modifié (le gène d'intérêt flanqué par des ITR d'un élément mariner), les cellules transformées seront par la suite transplantées dans une femelle, et le gène d'intérêt sera exprimé dans la génération suivante.
Figure 6.8 : Les différentes
étapes de la transgénèse à l'aide de
mariner chez la souris III.2. Les MLEs potentiellement actifs : Plusieurs éléments mariner ont été découverts mais la majorité d'entre eux sont inactifs parce qu'ils accumulent des mutations ponctuelles ou des délétions. Ainsi il existe 9 transposons potentiellement actifs,
c'est-à-dire que leurs ORFs sont présents dans le tableau ci-dessous : (In Halaimia Toumi, 2006) Tableau 4 : Quelques éléments
mariner potentiellement actifs (In Halaimia Toumi,
III.3. La caractérisation des transposons de type mariner : La caractérisation d'un transposon se fait en suivant 4 étapes principales : III.3.1. Recherche des éléments mariner à partir de l'ADN génomique par PCR : III.3.1.1. Extraction de l'ADN génomique: L'ADN est extrait à partir des organismes entiers et de tissus congelés à -80°C ou dans l'azote liquide. L'échantillon sera broyé dans du tampon de préservation. Les protéines et les débris cellulaires peuvent être éliminés par un traitement au phénol/chloroforme. Les acides nucléiques seront ensuite précipités à -80°C par de l'acétate de sodium et de l'éthanol absolu. Un traitement à la RNAse A et une ultracentrifugation sur gradient de Chlorure de Césium permettent d'achever la purification. Après ultracentrifugation, l'ADN peut être récupérer sous rayonnement ultraviolet. Le Bromure d'Ethidium est ensuite éliminé par des lavages successifs à l'isopropanol saturé par une solution de NaCl. L'ADN se précipite par addition de l'eau ultra pure et de l'isopropanol pendant 2 heures à -20°C. Après centrifugation, le culot sera repris dans l'acétate de sodium et l'ADN sera reprécipité en ajoutant de l'éthanol absolu pendant 2 heures à -80°C. Après centrifugation 15 minutes à 15000g, le culot d'ADN doit être lavé avec de l'éthanol 70°C (In Halaimia Toumi, 2006). III.3.1.1. PCR: Après extraction de l'ADN génomique d'un organisme, les transposons mariner seront recherchés par PCR (Polymerase Chain Reaction ou l'amplification en chaîne par polymérase) (In Halaimia Toumi, 2006). Inventée par Kary Mullis (prix Nobel de Chimie 1993), cette technique est utilisée pour amplifier une séquence d'ADN cible en utilisant une paire d'amorces d'oligonucléotides, chacune complémentaire à une extrémité de la séquence cible. Celles-ci subissent une élongation par une ADN polymérase thermostable (la Taq polymérase), dans un cycle de réaction à trois étapes : dénaturation, hybridation de l'amorce et enfin polymérisation (Figure7) (In Turner et al., 2002). Les amorces utilisées pour la recherche de ce type du transposon sont les amorces de Robertson décrites en 1993 et qui correspondent aux motifs conservés des transposases mariner (In Halaimia Toumi, 2006).
Figure 7 : Les différentes étapes de la technique PCR (D'après www.inrp.fr) III.3.2. Hybridation des éléments par la
technique de Southern Blot : Elle est utilisée acides nucléiques sur une membrane pour le repérage des séquences complémentaires à une séquence spécifique d'ADN ou d'ARN appelée sonde, la membrane d'hybridation est placée en sandwich entre le gel et un papier absorbant qui assure l'entraînement de solution-tampon à travers le gel (Figure 8) (In Primose et al., 2004). Les sondes utilisées pour le repérage des transposons mariner sont des transposons mariner apparentés car ils présentent un taux d'homologie très importants (In Halaimia Toumi, 2006).
Autoradiogramme Figure 8 : Schéma démontrant le principe de Southern Blot (D'après Griffiths et al. 2004) Marqueur de taille Électrophorèse ADN ou ARN Migration La solution passe à travers le filtre Éponge Gel Solution salée Filtre de nitrocellulose Filtre Hybridation avec une sonde Lavage pour enlever les liaisons non Le transfert de l'ADN Hybridation des III.3.3. Séquençage par la méthode de Sanger : Les fragments obtenus par les techniques précédentes seront envoyés au séquençage, une des méthodes de séquençage la plus utilisée est celle de Sanger. Cette méthode fait intervenir une étape de dénaturation des deux brins, une hybridation avec une amorce marquée radioactivement et une élongation par une ADN polymérase en présence de didésoxyribonucléosides triphosphate (ddNTP). Ces molécules peuvent être normalement incorporées dans un brin d'ADN en élongation grâce à leur extrémité 5' triphosphate mais ne peuvent pas former de liaison phosphodiester avec le nucléoside triphosphate suivant. Lorsqu'une faible quantité d'un ddNTP est présente (ddATP par exemple) en plus des quatre dNTP nécessaires pour la polymérisation (dATP, dCTP, dGTP et dTTP), plusieurs fragments marqués sont générés. Ils correspondent tous à des fragments portant un résidu ddATP à l'extrémité 3'. En répétant l'expérience pour les autres ddNTP et en séparant les différents fragments d'ADN de chaque réaction de polymérisation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (séparation selon la taille des séquences), la séquence du fragment d'ADN de départ peut être déduite. Aujourd'hui, des séquenceurs automatiques de l'ADN existent sur le marché. Ils sont capables d'effectuer l'électrophorèse et de déterminer directement la séquence nucléotidique par une lecture d'un ou de plusieurs fluorochromes (Figure 9) (In Primose et al., 2004).
75 ADN polymérase + 4dNTP Gel de polyacrylamide Brin d'ADN ADN Amorce marquée Amorce marquée ADN polymérase +4dNTP+ ddATP La séquence du gel La séquence originale Figure 9: Le séquençage selon la méthode de Sanger. (a) : l'addition d'une amorce marquée et ddNTP et poursuit de l'élongation. (b) : les fragments résultants des différentes réactions sont séparés par éléctrophorèse. (c) : le gel de séquençage de Sanger (d'après Griffiths et al., 2004) III.3.4. Analyse des séquences in siico : Les séquences obtenues seront analysées in silico par des logiciels de traitement de séquences spécifiques. Ces derniers comparent les nouvelles séquences par rapport aux autres séquences existantes dans la base des données, ainsi ils permettent la recherche des motifs caractéristiques. Par exemple, l'analyse d'un élément mariner issu d'un organisme des sources hydrothermales océaniques (l'élément Alvcmar du ver Alvinella caudata) a montré la présence des motifs conservés WVPC(R/X)NL et YSPDL(A/T)(P/H) au lieu des motifs WVPHEL et YSPDLAP définis par Robertson 1993. Ainsi ces analyses ont permis la mise en évidence de deux codons start, cette remarque permet d'émettre l'hypothèse que ce transposon peut coder pour deux isoformes différentes de la transposase (Figure 10). Cette transposase ressemble aux autres transposases des éléments mariner dans la triade catalytique D.D(34)D, le premier D se trouve au niveau d'un motif conservé DETWV, le second est localisé dans le motif HDN et le dernier se trouve juste après le motif YSPDL(A/T)(P/H). De plus, elle présente un feuillet â dans leur domaine N-terminal, et des hélices « HTH », enfin un signal potentiel de localisation nucléaire NLS a été observé dans la région C-terminal (Figure11) (In Halaimia Toumi, 2006). ITR5' 1298pb ITR3' UTR5' UTR3' 36pb 37 pb
TA ORFII = 1050 (350 aa) ATGI ATGI ORFI = 1140 (380 aa) Figure 10 : Structure nucléique de
l'élément Alvcmar (D'après Halaimia
Toumi, CGGTTAGGACTGGTTCTGAC AWG TTC ACA AGC AGC GCC GCT CCG CTC CCT CGC TCC CTC 130 X F T S S A A P L P R S L 13 CTC AGT CTT AAG GGA GCG AGC AGT GGA CGY GGT TGG CAG GAG TCG GCA ACA ATG 184
L S L K G A S S G R G W Q E S A T M 31 GAC AAG ATC GAG TAC CGT GCA GTG ATC AAG TTC TTG ACA AAA GAG GGG AAG AAC 238
Hélice á GCG AAG GAG ATC CAC GAC AGG CTG GTT GCG GTG TAC AAC GAC ACT GCC CCT TCG 292
Hélice á TAT GCC ACA GTC ACC CGC TGG CAC AAG GAA TTT CGT CAT GGC CGT GAG TCC CTT 346
Hélice á GAA GAC GAC CCC CGT GTG GGA CGC CCC TCC GAG GCG ACC TCC GAA GAC ATT GTT 400
GAT CGT GTG GAG GCA ATG ATC ATG GAG AAT CGG CGA GTG AAG GTG GAG GAA ATT 454
TCG TTG GAG ATT GGA ATT TCT CAT GGA AGC GTT TGC ACC ATT ATT CAT CAT CAC 508
Hélice tour hélice CTG GGC ATG AGC AAA GTT TCT GCT CGT TGG GTG CCC YGA AAT CTT TCT CTG CAT 562 L G M S K V S A R W V P X N L S L H 157 GAT CGC CTT CAG CGC CGC ACA AGT TCG GAG GAG CTG CTG ACT CTG TAC AAC GCA 616
Hélice á Hélice á GAC CCA GCG GGA TTC GAG TCG AGG GTC GTG ACA GGT GAT GAA ACG TGG GTT CAC 670 D P A G F E S R V V T G D E T W V H 193 CAC TGG GAC CCA GAG ACG AAG CTC GAG AGC ATG GCC TGG AAA CAC AAG GGA TCC 724 H W D P E T K L E S M A W K H K G S 211 CCG ACA CCG CTC AAG TTT CGG ACC CAA CCA TCG GCT GGC AAG ATC ATG GCC ACC 778 P T P L K F R T Q P S A G K I M A T 229 ATC TTC TGG GAC GCC GAG GGA GTG CTG CTG GTG GAC TTC CTG CCG CGT GGC TCT 832 I F W D A E G V L L V D F L P R G S 247 ACG ATC ACG GGG GAG TAC TAC GCC GGM GTA CTC GGT CGC TTG AGG GAC TCC ATC 886 T I T G E Y Y A G V L G R L R D S I 265 CGT CAG AAG AGG CGG GGC AAG TTG ACC CGT GGT GTC CTC CTC CTC CAC GAC AAC 940
NLS GCT CCG GTC CAC AAG GCC CGC CGT GCC CAG GCT GCT CTG AGG GAC TGC GGC TTC 994 A P V H K A R R A Q A A L R D C G F 301 GAG CAG CTC AAT CAC CCA CCC TAC AGT CCG GAC CTG GCC CCC AGT GAC TAC TTT 1048 E Q L N H P P Y S P D L A P S D Y F 319 CTG TTC CGC CAG CTC AAG TCC TCG TTG CGG GGG CGG AGG TTC GAC GAC GAT GAT 1102 L F R Q L K S S L R G R R F D D D D 337 GAG GTC AAG GAG GCT GTG ATG ATG TGG TTG GAG GAG CAG TCG GAA TCC TTC TGG 1156 E V K E A V M M W L E E Q S E S F W 355 CTG GCA GGA ATC CAG AGC CTT CGC GAC AAG TGG TTC AAG TGT ATT CAA GTC AAG 1210 L A G I Q S L R D K W F K C I Q V K 373 GGT AAT TAC ATT GAA AAA TGATGTGGTTATCATTTTCATTCCTCCGAAATAAAATACATACCGAA 1275 G N Y I E K * 379 TTGCAGAACTTTCTGACCGCCCCTCGTA |
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