2.2.5.4 Dosage des anticorps IgG, IgM, IgA
Le dosage des anticorps a été
réalisé à l'aide de la téchnique d'immunodiffusion
radiale (IDR) par Mancini et al et ont décrit la relation
existante entre la concentration des antigènes et le diamètre des
anneaux immunoprecipitine formés dans le système gel - anticorps
(Mancini et and Heremans ,1965).
Les sérums a analyser ont étaient
déposés dans des puits creusés dans une couche de gel
d'agarose contenant un antisérum spécifique (IgM, IgA, IgG)
(Cypress diagnostics, Longdorp Belgium).
Au fur et à mesure de la diffusion des protéines
sériques dans le gel, un précipité circulaire de forme
entre les anticorps du sérum et les anticorps anti IgG, IgM ou anti IgA
de l'antisérum.
La surface du cercle délimité par le
précipité est proportionnelle à la concentration en
anticorps tésté.
Dans des boites en plastique de 8.5 cm de diamètre sont
coulés 15 ml de gel d'agarose (Agarose Powder, Bio.RAD Laboratories,
Minimum Gelation, concentration 0.35%, catalog NO 1620100 32nd & GRIFFIN,
RICHROND CALIF) à 1.6% en tampon PBS additionné de 120 ìL
de noir d'amido (afin de poursuivre le processus de diffusion) (Na Cl/ KH2PO4/
NaHPO4 ; 12 H2O/ KCL, PH = 7.2) et contenant une quantité de 2ul/ml
d'antiserum.
Des puits de diamètres de 2 mm sont pratiqués
à l'aide d'une seringue, chaque boite contient 8 puits.
Dans chaque puits est déposé 8 ìL de
sérum à l'aide d'une micropipette (Accumax PRO, 608062 CE).
Des gammes de référence ont été
constitué par des solutions standards d'IgG, IgM et d'IgA de
concentration connue ( IgG ;320mg/dl ;1220mg/dl ;2500 mg/dl, IgM ;30 mg/dl ;130
mg/dl ;280 mg/dl, IgA ;48 mg/dl ;216 mg/dl ;432mg/dl),(Guide KALLESTAD
TM ENDOPLATE TM ;SINGLE RADIAL IMMUNODIFFUSION,SANOFI
DIAGNOSTICS PASTEUR).
Pour le control de qualité un échantillon de
control dans chaque dosage a été conclu (Cypress agnostics,
Longdorp, Belgium).
Les boites sont menies de leur couvercles et incubées
à température ambiante sur une surface plane horizontale dans une
chambre humide. Apres un temps de diffusion au point final (IgG ; = 48h, IgM ;
= 72h, IgA ; = 48h) les diamètres des anneaux d'immunoprécipitine
au 0.1mm au pré ont été mesurés.
La concentration du control et des échantillons
à tester a été déterminée en localisant le
carré du diamètre (en mm2) de l'anneau de chaque
échantillon sur une courbe de référence ajustée en
mieux, tracée à partir de la concentration de chaque sérum
standard sur l'axe des ordonnés en fonction du carré du
diamètre du précipitine sur l'axe des apsis.
Afin de visualiser les anneaux de précipitation, 15 ml de
noir d'amido a été coulé sur le gel et incubé
à température ambiante pendant 10 minutes.
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