Chapitre 2 : Méthodes et matériels.
2.1. Milieu d'étude.
Notre milieu d'étude était l'Université
Évangélique en Afrique (UEA) se situant en République
Démocratique du Congo dans la province du Sud-Kivu, ville de Bukavu.
Cette université se situe à 02°32'36,1» de latitude Sud
et 028°51'32,9» de longitude Est et 1661m d'altitude.
Notre étude s'est déroulée dans le
laboratoire de la biologie moléculaire à la faculté des
sciences agronomiques et Environnement, où la température
régnante est autour de 25°C. Dans ce laboratoire, la
préparation de la semence primaire et secondaire s'y était
effectuée dans des conditions aseptiques et les précautions
usuelles de manipulation étaient réunies tout au long de la
manipulation.
2 .2. Matériels utilisés.
a) Matériel biologique.
La souche P969 de l'espèce Pleurotus ostreatus
a été utilisée comme matériel biologique. Elle
a été choisie pour son adaptabilité dans la région
tropicale et son appréciation par la population consommatrice. Elle
présente les caractéristiques particulière dont : le
diamètre chapeau (carpophore) convexe, charnu, bombé puis plat
parfois un peu déprimé (en coquille). La marge est
enroulée, gris ardoisé avec des reflets bleuâtres, parfois
gris beige, gris brunâtre (colorations assez variables). Lames peu
décurrentes et peu serrées, blanches. Stipe souvent court
(parfois nul), excentrique à latéral, blanc. Chair blanche
à odeur agréable.
b) Matériel chimique.
Les matériels chimiques utilisés dans la
présente étude étaient les antibiotiques. Trois
antibiotiques ont été utilisés. Il s'agit du
chloramphénicol et de la gentamicine (bactéricides) et du
bénomyl (fongicide). Les caractéristiques relatives à ces
différents antibiotiques sont décrites dans la revue de la
littérature.
c) Matériels du laboratoire.
Ces matériels sont ceux qui étaient utilisés
pour l'exécution de nos expériences :
1°) La boite de pétri : servait à recevoir
le milieu de culture, c'est un bocal de conservation de la gélose. La
boite de pétri a un diamètre de 8,6cm et une surface de
58cm2soit 5,8.10-3m2.
Figure 2 : Dispositif
Expérimental.
--' 21 --'
2°) Balance de précision : elle nous aidait
à déterminer exactement la quantité de substances à
utiliser dans le milieu de culture.
3°) Stérilisateur : c'est un instrument qui nous
permettait de stériliser les outils pour éviter la
contamination.
4°) Les éprouvettes, l'erlenmeyer (ballon à
fond plat) : aidait pour le mélange des solutions.
5°) Autocuiseur et autoclave : pour stériliser les
récipients destinés au blanc (Wageningen, 2005).
7°) Les écouvillons : nécessaires pour
l'écouvillonnage consistant à faire rouler délicatement
les écouvillons sur les milieux sélectifs.
10°) Le bec bunsen (à flamme), pour la
stérilisation : travailler autour de 30cm à coté du bec
bunsen pour assurer l'asepsie.
11°) Incubateur : pour l'incubation à 27°C
pendant 7-10 jours.
2.3. Méthodes.
2.3.1. Dispositif expérimental.
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V1
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T1
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T2
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T3
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T
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V2
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T1
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T2
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T3
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T
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Notre essai a été conçu suivant un
dispositif en split-plot. Deux facteurs étaient en étude : le
facteur principal était le type de culture avec deux modalités
(culture tissulaire et culture sporée) et le facteur secondaire,
l'antibiotique avec quatre modalités (chloramphénicol,
gentamicine et bénomyl et témoin). Les différents
traitements sont repris dans le dispositif ci-dessous.
--' 22 --'
Légende.
V1= culture tissulaire , V2= culture sporée. T =
témoin , T1=bénomyl.
T2= chloramphénicol , T3= gentamicine.
2.3.2. Conduite de l'essai.
a. Préparation du milieu de culture, PDA pour
la semence primaire.
Pour la préparation de milieu de culture, PDA (pomme de
terre, dextrose et agar) il fallait :
-Prendre 200g de pomme de terre dans un litre d'eau ;
-Ajouter 20g de dextrose ;
-18(20) g d'agar ;
-Faire la filtration sur papier -filtre ou sur tissu ;
-Ces milieux sont coulés dans des boites de
pétri à raison d'au moins 20ml par boite de pétri ; les
milieux et la verrerie doivent être stérilisés (Paulus,
1992).
b. Préparation des semences à utiliser
dans la culture. Deux types de semences à utiliser pour
évaluer l'effet de type de culture :
-Les tissus : prendre une partie de la
souche Pleurotus ostreatus ; puis repiquer les fragments dans
différentes boites de pétri sur PDA de façon aseptique.
Maintenir l'incubation à 27°C Pendant 7-9Jours.
-Les spores : après préparation
du milieu de culture ; PDA (filtration de cuisson dans un litre d'eau
déminéralisée de 200g pomme de terre+20g agar +20g
dextrose, porté à 1l).Le milieu est chauffé pendant
environ 15minutes jusqu'à dissolution des ingrédients et
obtention d'un mélange homogène qui est réparti dans des
tubes à essai. Ces derniers doivent être bouchés avec un
tampon d'ouate coiffé d'un morceau de papier aluminium avant
d'être stérilisés (120°C, 15-20minutes et une pression
de 1 atmosphère). Après stérilisation, les tubes sont
placés en position inclinée afin de maximiser la surface de
contact du milieu de culture après refroidissement. La sporulation est
obtenue en plaçant dans le goulot du tube à essai contenant le
milieu de culture, un morceau de chapeau de Pleurotus ostreatus
fixé à un ruban para film,
--' 23 --'
face hymeniale dirigée vers le milieu de culture. 12h
après, le morceau de chapeau est enlevé et le tube à essai
est rebouché en conditions aseptiques au-dessus de la flamme d'une lampe
à alcool. Le tube inoculé est placé dans un incubateur
Millipore à 32°C pendant 48h (Dibaluka, 2005).
c. Contrôle d'infections.
Après que les conditions aseptiques soient
réunies ; nous appliquerons les antibiotiques (chloramphénicol et
gentamicine) et le fongicide (bénomyl). Les antibiotiques seront
appliqués pour inhiber la colonisation bactérienne des milieux de
culture et le fongicide sera utilisé pour anéantir d'autres
colonisations fongiques autres que la souche en culture. La quantité
d'antibiotiques qui sera utilisée est de 0,5g /l.
N.B. Les antibiotiques sont soit en injection ou des
comprimés.
d. Paramètres à observer lors de la
culture in vitro.
-Le taux de reprise ;
- Jour de reprise ;
- Abondance de la colonisation mycélienne en culture ;
-Homogénéité mycélienne
c.à.d. présence ou non d'infections (bactériennes par
exemple) ;
-Longueur et vitesse de croissance mycélienne
était évaluée à l'aide d'une latte graduée.
Ainsi la vitesse de croissance sera calculée en utilisant la formule
suivante : Vn-Vn-1/Nbre de jour, ensuite la moyenne de variation sera
calculée, V1+V2+Vn.../Nbre de jour.
e. Préparation de la semence
secondaire.
Le substrat utilisé pour la préparation de la
semence secondaire était constitué des grains de sorgho. Les
grains de sorgho ont été cuits dans une casserole pendant 2
à 3h, puis essoré au soleil pour débarrasser le sorgho de
l'eau, le son de maïs a ensuite était ajouté au sorgho mais
en petite quantité en raison de 200g pour 2,5 kg de sorgho puis ont
été répartis dans les bocaux(boites à mayonnaise.
Les bocaux ont été ensuite hermétiquement fermés et
un tampon d'ouate fut placé au milieu du couvercle vissé et enfin
la stérilisation était faite à l'autoclave à une
température de 121°C pendant 30 à 45 minutes.
Après la stérilisation, les bocaux furent
refroidis pendant 45minutes. L'inoculation du mycélium (semence primaire
« stater ») sur le substrat de semis secondaire a été
réalisée à
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côté d'un bec bunsen, dans des conditions de
stricte asepsie. Le matériel de prélèvement et de
transfert de l'inoculum a été stérilisé grâce
à la flamme du bec bunsen. L'incubation des grains de sorgho a
été réalisé dans les conditions de 27° pendant
21 à 30 jours dans une l'obscurité totale, dans un milieu
fermé, et le produit obtenu à l'issue de cette opération
est appelé « blanc-mère » ou « blanc de semis
».
f. Analyses des données.
L'analyse des données a été
réalisée par l'utilisation du logiciel Excel version 2007. Ici,
les données seront décrites par les moyennes de diamètre
mycélien en fonction des milieux de cultures et d'antibiotiques; et le
niveau d'infections dans chaque types de culture et d'antibiotiques. La
régression linéaire était réalisée pour voir
la corrélation existant entre le niveau d'infections et le
diamètre mycélien en fonction de types de culture et
d'antibiotiques.
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