2. 2. 2. Analyse de la diversité
intra-spécifique par PCR-RFLP de l'ADNr 16S
L'analyse du polymorphisme de la longueur des fragments de
restriction du gène de l'ADNr 16S amplifié par PCR a
été utilisée dans un second temps.
Cette méthode, qui est l'une des plus utilisées
pour l'identification des rhizobiums (Young et al., 2001) permet de
regrouper les souches bactériennes à un niveau de
résolution taxonomique qui s'étend de l'espèce au genre
(Heyndrickx et al., 1996).
Le gène ribosomique de l'ADNr 16S des 45 souches de
sulla a été amplifié. L'amplification a donné lieu
à une bande unique révélée par
électrophorèse chez l'ensemble des souches. La taille de la bande
a été évaluée visuellement par comparaison au
marqueur et correspond approximativement à 1500 pb (Figure 28).
1500 pb
Figure 28: Amplification de l'ADNr 16S de
quelques souches nodulant le sulla.
Le gène de l'ADNr 16S amplifié par PCR des 45
souches a été sujet à une digestion par 2 enzymes de
restriction (MspI, NdeII) (Figure 29). Les profils obtenus
par chaque enzyme et pour chaque souche ont été
désignés par des lettres alphabétiques (Tableau 15). Les
mêmes profils ont été comparés par paire afin
d'établir le ribotype correspondant à chaque souche.
Les profils obtenus montrent une variation des bandes en
nombre de 2 à 8 et en tailles (de 70 à 1300 pb) selon la souche
et l'enzyme. Un profil majoritaire (AA) représente 32 parmi les 45
souches de la collection. Le reste des isolats a donné des ribotypes
différents les uns des autres. Ce travail a été
complété par un séquençage de l'ADNr 16S des
souches ayant des profils différents ainsi que de 7 souches
représentatives du profil majoritaire (AA).
A B
HC8 HC11 HC12 HC13 HC17 HC29 HC34 HC36 M HC14 HC16
HC45 HC38 HC39 HC24 HC25 HC26 HC27 HC28 M HC30 HC31 HC32 HC33 HC36
HC45 HC38 HC39
Figure 29: Profils
électrophorétiques de la restriction par RFLP de l'ADNr 16S
obtenus pour quelques souches de la collection après digestion par les
endo-nucléases MspI (A) et NdeII (B).
Tableau 15: Ribotypes des souches isolées
du sulla et déterminés par PCR/RFLP du gène de l'ADNr
16S
|
Profil
MspI
|
Profil
NdeII
|
Ribotype
|
Souches
|
|
A
|
A
|
AA
|
HC1, H, HC3, HC4, HC5, HC6, HC7, HC8, HC9, HC14, HC16, HC18,
|
|
|
|
HC19, H0, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8,
H9, HC30, HC31,
HC32, HC33, HC35, HC37, HC41, HC42, HC44
|
|
B
|
B
|
BB
|
HC10
|
|
B
|
D
|
BC
|
HC11
|
|
C
|
D
|
CD
|
HC12
|
|
D
|
E
|
DE
|
HC13
|
|
E
|
F
|
EF
|
HC15
|
|
F
|
G
|
FG
|
HC17
|
|
G
|
H
|
GH
|
HC34
|
|
H
|
I
|
HI
|
HC36
|
|
I
|
J
|
IJ
|
HC38
|
|
J
|
K
|
JK
|
HC39
|
|
K
|
L
|
KL
|
HC43
|
|
L
|
M
|
LM
|
HC45
|
| 
