II.2.3.2. OEstrus
L'oestrus est le résultat de l'action de l'oestradiol
sur le système nerveux central et amenant jusqu'aux manifestations
psychiques des chaleurs. Durant 14 à 18 heures, la vache est en oestrus,
elle est anxieuse et sans repos, son appétit diminue (Sartori et Barros,
2011).
La connaissance de l'anatomie et de la physiologie de l'ovaire
demeure un des pré-requis pour l'application des biotechniques de
reproduction assistée telles que l'insémination artificielle, la
synchronisation des chaleurs, le transfert d'embryon et la production in
vitro d'embryons.
19
B. PRODUCTION IN VITRO D'EMBRYONS
La production in vitro d'embryons nécessite la
collecte préalable des complexes ovocytes cumulus-oophorus (COCs)
à partir des ovaires. La qualité des follicules et des ovocytes
collectés à partir de ces ovaires est un pré-requis pour
la maturation et la fécondation in vitro des ovocytes (Boni,
2012).
I. Technique de collecte des ovocytes
Les ovocytes peuvent être collectés soit sur des
ovaires d'animaux abattus, soit sur des animaux vivants.
I.1. Collecte des ovocytes à partir des ovaires
prélevés sur des animaux abattus (ex vivo)
Les ovocytes peuvent être récoltés
à moindre coût pour la production in vitro d'embryons
à grande échelle (Agrawal et al., 1995) à partir
d'ovaires des vaches de tout âge y compris les foetus collectés
après abattage (Natumanya et al., 2008). Plusieurs techniques
de collecte ont été développées.
I.1.1. Aspiration des ovocytes
Dans cette technique, les follicules visibles sur l'ovaire
sont aspirés à l'aide d'une aiguille 18G (Gauge) et d'un
système d'aspiration (#177; 1 bar) ou d'une pompe à vide (100-150
mm Hg) (Satrapa et al., 2010).
I.1.2. Slicing des ovaires
Selon cette technique, les ovaires sont placés dans une
boîte de pétri contenant 5 ml du Dubelcco Phosphate Buffered
Saline (DPBS). Des sections multiples sont faites sur la surface ovarienne
avec une lame de bistouri (Wang et al., 2007). Cette technique permet
de récupérer les ovocytes présents dans tous les
follicules quelle que soit leur localisation au niveau du cortex ovarien,
augmentant ainsi le rendement en ovocytes. Elle a pour inconvénient de
produire beaucoup de débris tissulaires, ce qui rend la recherche des
ovocytes difficile (Wani et al., 1999).
I.1.3. Ponction des follicules
Les ovaires, tenus par une pince, sont submergés dans
une solution physiologique (DPBS) contenue dans une boîte de
pétri, puis les follicules visibles sont ponctionnés par une
aiguille de 18-G et le fluide folliculaire est récupéré
(Wang et al., 2007).
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I.1.4. Dissection des follicules
Les follicules antraux intacts ou partiels sont
disséqués et placés en maturation. Cette technique permet
d'exclure les follicules atrétiques et d'obtenir d'ovocytes de meilleure
qualité (Foudani et al., 1998).
I.2. Collecte des ovocytes par ovum pick-up (in
vivo)
Les ovocytes immatures peuvent aussi être
collectés par ponction des follicules ovariens visualisés sur
l'écran d'un échographe sur des vaches vivantes. Elle est
réalisée par voie transvaginale à l'aide d'un pistolet
muni d'une sonde à ultrasons et d'une aiguille rétractable
reliée à un système d'aspiration. C'est la technique de la
ponction échoguidée ou OPU (Ovum Pick Up). Elle a
l'avantage d'être utilisée sur des animaux de haute valeur
génétique, et peut être répétée deux
fois par semaine chez la même femelle pendant plusieurs mois
(jusqu'à cinq) sans affecter apparemment la fertilité
ultérieure des animaux. Son inconvénient réside dans le
fait qu'elle a des résultats incertains et le rendement en ovocyte est
faible.
II. Evaluation de la qualité des
ovocytes
La qualité des ovocytes est définie selon cinq
niveaux (Sirard et al., 2006) :
- aptitude à reprendre la méiose ;
- aptitude à se diviser après la fécondation
;
- aptitude à se développer jusqu'au stade
blastocyste;
- aptitude à induire une gestation jusqu'à son
terme ;
- aptitude à développer l'embryon à terme et
en bonne santé.
Une évaluation fonctionnelle est toutefois difficile
à déterminer au moment de la
collecte des ovocytes. Plusieurs stratégies ont
été employées dans l'optique de fournir une valeur
prédictive du potentiel des ovocytes collectés pour la production
in vitro d'embryons. Les méthodes non invasives comme le
diamètre folliculaire et la morphologie des COCs ont été
utilisées comme critères de sélection des ovocytes de
bonne qualité.
II.1. Evaluation des ovocytes sur la base du
diamètre des follicules
Le diamètre folliculaire a été largement
utilisé comme un paramètre de sélection des ovocytes. Des
études ont établi une relation entre la taille du follicule et la
compétence au développement de l'ovocyte. La ponction des
follicules antraux est utilisée chez la vache à partir des
follicules de diamètre compris entre 3 et 8 mm (Abraham et al.,
2012). En effet, les follicules en dessous de 3 mm de diamètre donnent
un faible pourcentage d'ovocytes aptes à
21
acquérir la compétence méiotique. De
même, la dégénérescence des ovocytes suite à
l'atrésie des follicules est plus fréquente dans les follicules
de diamètre inférieur à 3 mm et supérieure à
6 mm (Anguita et al., 2007).
II.1. Evaluation sur la base des caractéristiques
morphologiques du cumulus oophorus
Après collecte ex vivo ou in vivo,
les ovocytes peuvent être dénudés ; mais, ils sont
généralement entourés d'une quantité plus ou moins
abondante de cellules de la corona radiata et du cumulus oophorus. Les ovocytes
sont classés selon la morphologie des COCs c'est-à-dire le nombre
de couches de cellules du cumulus oophorus et l'aspect du cytoplasme
évalué sur la base de l'aspect des noyaux. Les ovocytes
présentant un cytoplasme homogène sont davantage associés
à des COCs compacts. Inversement, un cytoplasme d'aspect granuleux et
polarisé, correspondant à une distribution
irrégulière de gouttelettes lipidiques et d'organelles
intracellulaires, est davantage associé à des follicules
atrétiques et à des COCs expansés (Salomone et
al., 1999). Selon ces critères, les ovocytes sont classés en
quatre qualités (De Loose et al., 1989 ; Alves et al.,
2014).
- Qualité 1 (Q1) : Cumulus pluristratifié (plus
de trois couches) compacté et un cytoplasme homogène ;
- Qualité 2 (Q2) : Cumulus compacté à une
ou deux couches et un cytoplasme moins homogène ;
- Qualité 3 (Q3) : couche des cellules
irrégulières avec un peu du cumulus oophorus moins
compacté et un cytoplasme moins régulier avec des zones sombres
;
- Qualité 4 (Q4) : absence de cumulus oophorus ou
expansé, cytoplasme irrégulier avec des zones sombres.
Le critère de sélection basé sur la
morphologie des COCs est important pour la réussite de la maturation
in vitro.
II. 2. Choix des ovocytes pour la maturation et la
fécondation in vitro
Les ovocytes et le cumulus oophorus (cellules somatiques
entourant l'ovocyte) sont reliés par des jonctions communicantes
permettant l'inter-échange des molécules et nutriments entre ces
cellules (Norris et al., 2008). L'efficacité de la production
in vitro d'embryons (PIV) est influencée significativement par
la qualité des ovocytes. Les COCs utilisés pour la PIV sont les
COCs de qualité 1 et 2, c'est-à-dire entourés d'un cumulus
compact (composé de 3 à 4 couches de cellules couvrant la zone
pellucide) et ayant un cytoplasme homogène (Cetica et al.,
1999; Wang et al., 2007). De nombreuses études ont
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montré que la compétence au développement
est proportionnelle à la qualité du complexe cumulus oophorus
ovocyte avec une différence des taux de développement
significatif entre les COCs des classes 1 et 2 acceptables d'une part et
d'autre part les COCs de classes 3 et 4 (Cetica et al., 1999).
III. Maturation in vitro des
ovocytes
L'objectif est d'obtenir la maturation nucléaire et
surtout cytoplasmique des ovocytes ayant déjà acquis la
compétence complète pour reprendre la méiose. Les cellules
des complexes cumulus oophorus ovocytes de qualité 1 et 2 sont mises en
maturation in vitro dans le milieu TCM 199 (Abraham et al.,
2012), milieu tamponné au bicarbonate, contenant des sels
minéraux, des sources de carbone et d'énergie (glucose,
glutamine) ainsi que des acides aminés et des vitamines. L'albumine
sérique bovine (BSA) ainsi que des liquides biologiques complexes
(sérum bovin foetal : 10 et sérum d'une femelle en oestrus : 10%)
et des antibiotiques (gentamycine (75ug/ml) (Satrapa et al., 2010)
sont souvent ajoutés à ce milieu dont l'effet empêche
l'adhésion des complexes cumulus ovocytes entre eux et au support de
culture.
IV. Fécondation in vitro des
ovocytes
La fécondation des ovocytes matures s'effectue avec
des spermatozoïdes qui ont subi au préalable la capacitation. Il
s'agit de l'entrée du spermatozoïde dans l'ovocyte permettant
l'incorporation du contenu nucléaire mâle dans le gamète
femelle. La fécondation in vitro est réalisée en
puits (20 à 30 ovocytes) ou en microgouttes (20 ul) en présence
de 106 spermatozoïdes par ml. L'incubation dure 18 à 24
heures dans une atmosphère modifiée contenant 5% de C02 à
38.8° C (Abraham et al., 2012).
V. Culture des embryons
La culture des embryons est une étape cruciale pour la
production d'embryons in vitro. Chez les mammifères
domestiques, c'est au stade blastocyste que l'embryon est transférable
dans l'utérus de la femelle receveuse. La culture jusqu'à ce
stade est donc indispensable. C'est également à ce stade que
l'embryon est apte à supporter la
congélation/décongélation. Les zygotes obtenus sont mis en
culture dans un milieu contenant tous les composés dont l'embryon a
besoin.
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VI. Facteurs de variation de la population folliculaire,
du rendement et de la qualité ovocytaires
Les facteurs tels que la race, l'âge, le niveau
hormonal, le stade de reproduction et la nutrition ont été
cités antérieurement comme influençant la population
folliculaire et le rendement en ovocytes des différentes espèces
d'animaux domestiques.
IV.1. Facteurs ovariens IV.1. 1. Corps jaune
Plusieurs études ont montré l'effet du corps
jaune sur la population folliculaire. Les résultats sont parfois
controversés. La présence du corps jaune (Dominguez, 1995;
Natumanya et al., 2008) ou son diamètre (Hanzen et
al., 2000) n'affecte pas le développement des follicules ovariens
sur l'ovaire hétérolatéral ou ipsi-latéral. Par
contre, d'autres auteurs ont montré que l'activité folliculaire
serait plus grande sur l'ovaire porteur de corps jaune que sur l'ovaire
hétérolatéral chez la vache pendant le cycle oestral
(Driancourt et al., 1991) ; et pour d'autres encore, l'ovaire
hétérolatéral au corps jaune a plus de follicules ovariens
chez le dromadaire (Abdoon, 2001), chez la chèvre (Swchwarz et Wierzcho,
2010) et chez la brebis (Shabankareha et al., 2010). Lors de la
gestation cependant, le corps jaune exerce une influence négative sur la
croissance des follicules de diamètre supérieur à 7 mm sur
l'ovaire ipsi- latéral (Pierson et Ginther, 1987a).
Le rendement et la qualité des ovocytes ne sont pas
affectés par la présence du corps jaune sur l'ovaire des vaches
de races Bos Taurus (Dominguez, 1995) et Bos Indicus
(Natumanya et al., 2008). Mais, d'après Samad et Raza
(1999), Wani et al. (2000) et Abdoon (2001), les ovaires
possédant un corps jaune ont un rendement plus faible en ovocytes que
les ovaires sans corps jaune chez la bufflesse, la brebis et la femelle du
dromadaire.
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