2.2. Screening biologique et analyse biologique de l'extrait
brut
Ici le matériel végétal est
partagé entre l'eau et un solvant organique polaire comme
l'éthanol ou le méthanol et les extraits bruts obtenus sont
examinés biologiquement. Les tests biologiques ont pour but de mettre en
évidence les activités pressenties dans la plante.
La solution la plus active est extraite avec
différents solvants organiques en vue de réaliser la
séparation de différents métabolites secondaires de
l'extrait brut et les différents extraits obtenus sont analysés
biologiquement.
2.3. Screening phytochimique de l'extrait brut
L'extrait le plus actif obtenu précédemment est
soumis à un screening phytochimique pour identifier les groupes de
composés présents et prévoir le mode d'extraction à
utiliser ultérieurement.
- Recherche des alcaloïdes (réactif de Mayer,
réactif de Dragendorff)
- Recherche des flavonoïdes (acide chlorhydrique et
copeau de Mg puis extraction par l'alcool isoamylique : réaction de
Shinoda)
- Recherche des saponines (test de mousse)
- Recherche des hétérosides cardiotoniques
(réactif de Keller-Killiani et réaction de Kedde)
- Recherche des stérols (réactif de Libermann -
H2SO4, anhydride acétique)
- Recherche des tanins (solution chlorhydrique de
FeCl3 et gélatine salée)
- etc.
2.4. Isolement et purification des composés de
l'extrait actif
Cette étape nécessite la combinaison de
plusieurs techniques chromatographiques : chromatographie sur colonne,
chromatographie sur papier, chromatographie sur couche mince CCM,
chromatographie liquide haute performance HPLC, chromatographie liquide en
phase gazeuse GLC, ainsi que la cristallisation.
2.5. Analyse biologique et identification des composés
isolés
Ici on procède à nouveaux à des tests
biologiques in vitro ou in vivo, puis on procède
à l'identification des composés isolés :
- déterminations des constantes physiques ;
- caractères organoleptiques ;
- masse moléculaire et formule brute par
spectrométrie de masse ;
- diffraction aux rayons X ;
- spectre UV, IR et RMN
2.6. Quantification et comparaison des effets biologiques
à des composés de référence
Les expériences peuvent se faire in vitro ou
in vivo. Les tests pharmacologiques spécifiques in
vivo consistent à provoquer une maladie chez l'animal et à
observer l'effet d'un échantillon (produit) sur cette maladie.
L'activité quantifiée est comparée à un produit
connu et/ou à un produit de référence, ceci pour voir si
le produit testé possède l'activité recherchée
d'une part et s'il peut par exemple remplacer un produit connu utilisé
pour la pathologie expérimentée d'autre part.
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