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Recherche de substances bio actives de centaurea microcarpa coss et dur.


par Maroua FERHAT
Université de M'sila - Diplôme étude supérieur de biochimie 2009
Dans la categorie: Biologie et Médecine
   
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IV.5.1.2.Mise en évidence des tanins:

Quelques goutes d'une solution de FeCl3 à 5% sont ajoutées à 5 ml d'infuser la réaction donne une coloration bleue noir en présence des tanins.

IV.5.1.3. Mise en évidence des anthocyanes:

Quelques goutes d'ammoniaque (1/2) sont ajoutées à 5 ml d'infuser la réaction donne une coloration bleu en présence d'anthocyanes (Mamyrbékova-Békro et al., 2008).

IV.5.1.4. Mise en évidence des coumarines :

Mettre environ 1g d'un échantillon de la plante humide dans un tube à essai, couvrir. le tube avec du papier filtre imbibé avec une solution de NaOH diluée, papier filtre est examiné sous lampe UV (254nm) .une coloration de jaune fluorescent indique la présence des coumarines (Dohou et al ,2003). IV.5.1.5. Mise en évidence des saponosides :

Leur présence est déterminée quantitativement par le calcul de l'indice de mousse. Ajouter 2ml d'eau distillée jà 5ml d'infuser, bien agiter le tout pendant 2min. Après un repos de 15 min en position verticale, on relève la hauteur de la mousse persistante en cm. (Dohou et al., 2003).

IV.6.Séparation des extraits méthanoliques brutes par Chromatographie sur couche mince(CCM):

V.6.1. Principe de la méthode:

La séparation et la purification des différents composés phénoliques sont fondées sur des techniques chromatographiques sur polyamide, Cellulose, gel de Sephadex, etc.....

Pour ce qui est de notre analyse, on se sert de la chromatographie sur couche mince (CCM) pour identifier les substances en fonction de leur façon de migrer dans les conditions données .La migration est en fonction de la polarité des substances, de la polarité de l'éluant et du pouvoir d'adsorption de la phase stationnaire. La méthode CCM est efficace et rapide et associe la sensibilité à la simplicité (Kolai et al, 2006) (figure16).

Figure 16 : Principe d'une séparation CCM

IV.6.2. Mode opératoire :

Les deux extraits méthanoliques obtenus des deux méthodes ont fait l'objet de la séparation par CCM suivant les étapes décrites ci-dessous :

IV.6.2.1. Préparation de la plaque :

Les plaques de gel de silice (60 F 254, Merck), sont découpées selon les dimensions suivantes ; 5, 5et6cm de largeur pour 8, 10 et 12cm de hauteur.

On tracer au crayon gris, délicatement, une ligne, appelée ligne de dépôt, à environ un centimètre du bord inférieur de la plaque à chromatographie. On repère la position des dépôts à effectuer sur la ligne tracée précédemment par des lettres qui désignent les extraits, exemples (Ex1, Ex2,...., etc.) en veillant à les espacer régulièrement

IV.6.2.2. Préparation de la cuve :

On introduit l'éluant (système solvant) dans la cuve à chromatographie, d'une largeur de 12 cm et de 14 cm de longueur, de manière à ce que son niveau atteigne une hauteur d'environ un demicentimètre. On couvre la cuve avec un couvercle hermétique.

IV.6.2.3. Dépôt :

On dépose, à l'aide d'une micropipette sur la ligne de dépôt une goutte de chaque extrait

à analyser ainsi que celles de référence (quercétine et acide gallique). Les dépôts sont espacer régulièrement afin d'éviter leur chevauchement lors de la migration. On peut concentrer les dépôts si nécessaire en répétant plusieurs fois les dépôts.

IV.6.2.4. Elution :

Plusieurs systèmes solvants, tirées à partir de la bibliographie, ont été utilisées pour mieux séparer les différents composées polyphénoliques éventuellement présents dans l'extrait méthanolique (Tableau 09).

L'éluant (système solvant) remonte par capillarité le long de la plaque. Lorsqu'il arrive à environ 1 cm du bord supérieur (front du solvant), on fait sortir la plaque de la cuve et on la sèche.

Après ces étapes, on procède à la révélation des chromatogrammes sous chambre UV (Camag) à 254nm et à 366nm

Tableau 09: Les différents systèmes solvants utilisées pour la CCM.

Systémes Solvants Rapport (v/v)

Chloroform. 10

01 Methanol 2

Dichloromethane. 5

02 Methanol 1

Acétate d'éthyle. 8

03 Acide acétique. 1

Eau. 1

Acétate d'éthyle. 8

04 Acide formique. 1

Eau. 1

Acétate d'éthyle. 2

05 Ether diethylique. 8

Dichlorométhane. 9

06 Acétate d'ethyle. 1

Acétate d'éthyle. 7

07 Methanol. 1,5

Eau. 1,5

Acétate 9

08 n- butanol 1

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