Les bactéries hautement résistantes émergentes.

I. Cadre d'études :

L'étude a été réalisée au niveau du service de Microbiologie du CHU Benbadis

Constantine, il s'agit d'une étude rétro et prospective étalée sur une période de 16 mois allant du 01 janvier 2018 jusqu'au mois d'avril 2019.

II. Matériel et méthodes :

II.1 Matériel :

Pour notre étude, on a utilisé le gros matériel comme les étuves ,le microscope optique

,ainsi que les pipettes pasteurs ,les lames et les lamelles ,les becs benzène ,les colorants comme le bleu de méthylène, les milieux de culture et d'isolement (Hektoen ,Chapman ,gélose chocolat ,le milieu d'enrichissement BCC), les milieux d'identification de la galerie

classique (TSI ,citrate de Simmons, milieu urée- indole ) et de l'antibiogramme (Mueller
Hinton, Mueller Hinton chocolat ), l'automate d'identification et d'antibiogramme le Walkaway 96 plus.

II.2 Méthodes :

II.2.1 Modalités de collecte des données :

Le recueil des données a été fait à partir des fiches d'antibiogramme dans différentes unités de bactériologie générale, d'hémoculture, les urgences médicales, la réanimation, ECBU et coproculture du service du microbiologie et logiciel WHONET et les registres.

II.2.2 Méthodologie microbiologique :

II.2.2.1 Prélèvements :

Les prélèvements sont reçus et vérifiés par rapport à leur conformité, ils doivent être

accompagnés d'une fiche de renseignements correctement remplie, ils sont ensuite numérotés et enregistrés. Les prélèvements étudiés et inclus dans notre travail sont :

? Hémoculture :

Correspond à l'ensemencement du sang de malade prélevé par ponction veineuse dans un bouillon spécifique, il peut s'agir d'un milieu simple citraté ou la plus part du temps des milieux des flacons d'hémoculture des automates : BACT/ALERT et VERSA TREK.

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+ ECBU :

Le prélèvement se fait à partir des urines matinales par la technique du milieu de jet (les

urines doivent séjourner au moins 3 à 4 heures dans la vessie).

+ Dispositifs de soins :

L'utilisation des matériels de soins chez les patients expose ces dispositifs à un risque

de colonisation par les microorganismes, pouvant déboucher sur une infection.

L'examen bactériologique de ces dispositifs a pour but de rapporter l'existence d'un état

septique à leur colonisation par un ou plusieurs microorganismes.

On note : les sondes, les drains et les cathéters.

+ Les suppurations:

Le liquide ou la sérosité des lésions sont aspirés par une aiguille fines ou frottés par écouvillon.

+ Les liquides de ponctions :

· Ponction lombaire : c'est un prélèvement du liquide céphalorachidien effectué entre deux vertèbres avec une aiguille fine.

· Ponction d'ascite : consiste à introduire un trocart dans la cavité péritonéale entre les deux feuillets pariétaux et viscéraux, pour prélever ou évacuer un liquide pathologique «l'ascite», dans un but diagnostique ou thérapeutique.

· Ponction pleurale: consiste à l'insertion d'une aiguille dans l'espace pleural, afin de soustraire et d'analyser le liquide pleural.

· Ponction articulaire : consiste à mettre en place une aiguille dans l'articulation afin de prélever le liquide articulaire.

+ Coproculture :

Le prélèvement des selles est réalisé par le patient dans un récipient stérile ou par écouvillonnage rectal.

+ Les prélèvements respiratoires :

· Prélèvement trachéal : l'aspiration endotrachéal est réalisée au moyen d'un système d'aspiration relié à une sonde d'aspiration stérile introduite dans la trachée.

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II.2.2.2 Diagnostic microbiologique :

a. Examen macroscopique :

Toute infection bactérienne s'accompagne, outre la présence de bactéries, de signes

biologiques liés à l'inflammation avec l'éventuelle présence de leucocytes. Ces éléments

peuvent entrainer au-delà d'un seuil, une modification visuelle, clairement perceptible à l'oeil

nu, qui signe une anomalie patente. On doit noter :

- l'aspect du liquide : trouble, purulent, clair...

- la couleur : hématurique, jaunâtre, blanchâtre...

- la consistance : fluide, épais, visqueux.

- l'odeur : une odeur fétide peut orienter vers un germe anaérobie.

b. Examen microscopique :

L'examen microscopique permet la caractérisation de différents types d'éléments cellulaires surtout inflammatoires ainsi qu'une éventuelle présence bactérienne.

? État frais (Grossissement X40) :

Une préparation est obtenue par le dépôt d'une goutte du prélèvement entre lame et lamelle pour être observer au microscope optique, ou par l'utilisation des cellules hématimétrique type cellule de Nageotte, durant cet examen il y aura une caractérisation quantitative ou semi quantitative des cellules inflammatoires présentes dans le prélèvement pathologique, ainsi qu'une éventuelle présence bactérienne tout en notant la mobilité et la forme.

? Examen après coloration (Grossissement X100) :

Un frottis fin est obtenu à partir du produit pathologique, puis coloré permettant une meilleure visualisation des bactéries et/ou des éléments cellulaires.

y' Coloration simple : Le frottis fin est traité par un seul colorant basique (bleu de méthylène). Cette technique est simple et rapide, utilisé pour l'appréciation de la réaction inflammatoire dans un produit pathologique ainsi que la présence éventuelle des bactéries.

y' Coloration différentielle : Compte tenu des différences structurales de la paroi des bactéries, la coloration de Gram découverte par Hans GRAM en 1884 permet de distinguer les bactéries colorées en violet (Gram positif) de celles en rose (Gram négatif).Il est alors possible de suspecter en tenant compte de la

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réponse Gram+ ou - et des morphologies observées d'évoquer un probable diagnostic

V' Examen après coloration spéciale (MGG) : La coloration de May-Grunewald-Giemsa (MGG) est principalement utilisée dans un but cytologique pour une meilleure individualisation des éléments cellulaires tels que les polynucléaires, macrophages, lymphocytes.

c. La mise en culture et isolement :

On procède à l'ensemencement du prélèvement afin d'isoler les germes pathogènes responsables de l'infection. Pour ce faire, on ensemence des milieux solides représentés par la gélose Hektoen ; milieu sélectif pour l'isolement des entérobactéries, milieu Chapman sélectif pour l'isolement des staphylocoques, ainsi qu'une gélose chocolat pour les germes exigeants, dans le service de Microbiologie la gélose ordinaire est utilisé pour l'ensemencement des prélèvements d'urines. Le bouillon coeur cervelle est également utilisé comme un milieu d'enrichissement. Les entérocoques peuvent pousser sur des géloses ordinaires, leur culture est plus aisée et plus abondante que celles des streptocoques.

d. L'identification :

L'identification des bactéries isolées à partir des différents prélèvements est basée sur l'étude de plusieurs caractères : morphologiques, biochimiques, enzymatiques et antigénique. Dans notre études des galeries biochimiques classiques ainsi que l'automate Walkaway 96 plus sont utilisés pour ce but.

> Tests biochimiques et enzymatiques :

V' Milieu TSI : la pente du milieu TSI est ensemencée par stries et le culot par piqure centrale, puis incubation à 37C° pendant 18 heures, il permet l'étude de 5 caractères : fermentation du glucose, lactose, saccharose, production de gaz et d'H2S.

V' Utilisation du citrate : la pente du milieu est ensemencée avec une strie sur toute la surface. Incubation à37°C, pendant 18 heures.

V' Milieu urée indole : ce milieu est ensemencé par quelques gouttes de la suspension bactérienne puis incubé dans l'étuve pendant 18h, il permet la recherche de la production d'uréase, tryptophanase et tryptophane déshydrogénase.

V' Mannitol-mobilité : l'ensemencement du milieu s'est fait par piqûre centrale jusqu'au fond du tube avec la souche à tester, incubation à 37C°durant 18 heures.

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y' Test de l'oxydase : ce test est réalisé à l'aide des disques prêts à l'emploi, imprégnés du réactif : N-diméthyl paraphénylène diamine, sur lesquels sont déposés des colonies. La lecture du résultat est immédiate et sans incubation.

y' Production de la catalase : une colonie est prélevée à partir de la boite de Pétri et déposée sur une lame. Une goutte de H2O2 (10 volumes) est déversée sur cette colonie.

y' Production de B-galactosidase (Disque d'ONPG) : le test est pratiqué en réalisant une suspension épaisse de la bactérie testée dans de l'eau distillée puis à l'aide d'une pince flambée et refroidie nous avons ajouté un disque imprégné d'ONPG et nous avons mis le tube dans l'étuve.

y' Test VP/RM : pour réaliser ce test, nous avons utilisé le milieu Clarck et Lubs et nous l'avons ensemencé par quelques gouttes de la suspension bactérienne. Après avoir incubé à 37C° pendant 18 heures nous avons partagé le milieu en deux tubes pour pratiquer les deux tests : Réaction de Voges-Proskauer en ajoutant quelques gouttes du réactif VP1 et le même volume du réactif VP2, la lecture s'effectue après quelques minutes. L'autre test est effectué par l'ajout du rouge de méthyle et la lecture est immédiate.

? Identification par automate Walkaway 96 plus :

C'est un indicateur Red/Ox pour détecter le métabolisme bactérien dans le milieu contenant un agent antimicrobien. Pour déterminer la croissance bactérienne, ils utilisent des mesures en continu des changements de l'indicateur, et la turbidité du milieu.

Microplaques 96 cupules

- ID : Identification (Base de donnée >450 germes)

- CMI : Antibiogramme (18 à 36 Antibiotiques testés par plaques)

- COMBO : Identification + Antibiogramme

2 technologies utilisées :

- conventionnelle (Turbidité-colorimétrie) - 18/24 h

- rapide (fluorescence) - 2 h ou 2 h 30

- mixte (fluorescence/Turbidité) - 2 à 18 h

18 profils de plaques différents en France.

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Plaques Combo : Concept permettant l'association de l'identification et l'antibiogramme sur la même plaque. Une seule et même suspension, standardisée à partir d'une colonie pour inoculer la plaque. Inoculation / Réhydratation de la plaque Combo en une seule et même étape grâce au Rénok. Une plaque = un test complet.

L'automate Walkaway fait l'identification et l'antibiogramme sous forme de CMI

Différentes plaques sont utilisées dans notre étude : NM 52 et NM 53 : identification et antibiogramme des entérobactéries, PC1A : identification et antibiogramme des streptocoques et entérocoques, NM37 : antibiogramme des bacilles à Gram négatif

Figure 11 : Automate Walkaway 96 plus.

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Figure 12 : Les plaques pour l'automate Walkaway.

? Identification des entérobactéries :

Toutes les souches d'entérobactéries sont : des bacilles à Gram (-), oxydase (-), catalase (+). Non exigeantes, immobiles ou mobiles par ciliature peritriche, fermentent le glucose avec ou sans production de gaz, aéro-anaéro facultatifs : elles sont capable de pousser en présence ou en absence de l'oxygène, nitrate réductase positive. Les principaux caractères différentiels entre les différentes espèces et les genres sont détaillés dans le tableau suivant.

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Tableau II : Les caractères différentiels entres les espèces et genre bactériens des entérobactéries.

	Escheri chia coli	Citrobacter	Enterobacter	Klebsiella	Serratia	^Salmonella	Shigella	Proteus
Glucose	+	+	+	+	+	+	+	+
Lactose	+	+	+	+	+	-	-	-
ONPG	+	+	+	+	+	-	-	-
Indole	+	+/-	-	+/-	-	-	+/-	+/-
VP	-	-	+	+	+	-	-	-
Citrate	-	+	+	+	+	+/-	-	+/-
Mobilité	+	+	+	-	+	+	-	+
Urée	-	-	-	+	-	-	-	+
TDA	-	-	-	-	-	-	-	+
H2S	-	+/-	-	-	-	+	-	+

? Identification des entérocoques :

Les entérocoques sont des cocci à Gram positif, immobiles, oxydase et catalase négatif, non exigeantes poussent sur des géloses ordinaires (sur gélose au sang, les colonies peuvent être non hémolytiques ou alpha hémolytiques), l'identification est également biochimique qui nous permet aussi la caractérisation des espèces : E.faecalis et E.faecium.

e. L'antibiogramme :

Il est réalisé pour toute souche isolée, différentes méthodes sont employées :

? La technique de diffusion sur milieu solide :

C'est l'étude de la sensibilité des germes aux antibiotiques par la technique de diffusion

en milieu gélosé Mueller-Hinton qui consiste à tester les antibiotiques actifs selon les recommandations du Clinical and Laboratory standard Institute (CLSI).

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· Le milieu :

La gélose Mueller Hinton (MH) coulée en boite de Pétri sur une épaisseur de 4 millimètre, elle peut être additionnée de 5 % de sang de cheval ou de mouton pour les bactéries plus exigeantes. Les géloses sont séchées avant l'utilisation.

· L'inoculum :

Á partir d'une culture pure de 18 à 24h sur milieu d'isolement, on prélève à l'aide d'une anse ou une pipette Pasteur quelques colonies bien isolées qu'on dissocie dans 10 ml d'eau physiologique stérile, bien homogénéiser la suspension bactérienne, sa charge doit être équivalente à 0,5 Mac Ferland (correspond à environ 108bactéries/ml).

· L'ensemencement :

L'ensemencement est fait par la méthode d'écouvillonnage :

- On fait tremper l'écouvillon dans la suspension bactérienne.

- On frotte l'écouvillon sur la totalité de la surface, de haut en bas, en stries serrées.

- L'opération est répétée deux fois, en tournant la boîte de 60 ° à chaque fois sans

oublier de Faire pivoter l'écouvillon sur lui-même.

- On finit l'ensemencement en passant l'écouvillon sur la périphérie de la gélose.

· Incubation :

Incuber pendant 18 -24 heures, à 35 - 37°C dans les 30 minutes suivant la préparation.

· Lecture et interprétation :

Faire la lecture le lendemain, en mesurant avec précision le diamètre de chaque zone d'inhibition de la croissance bactérienne, à l'aide d'un pied à coulisse métallique en mm et le noter (boite de pétri fermée).

Les résultats seront comparés aux valeurs critiques relatives à chaque antibiotique, selon les normes CLSI 2014.

Dans notre étude, les antibiotiques ont été testés :

? Les entérobactéries : Amoxicilline(AMX), Ticarcilline (TIC), Pipéracilline (PIP) Amoxicilline+ Acide clavulanique (AMC), Céfazoline (CZ), Céfoxitine (FOX), Céfotaxime (CTX), Aztréonam (AZT), Céfépime (CEF), Ertapénème (ERT) Imipenème (IMP), Fosfomycine(FOT), Amikacine (AK), Gentamycine (GM) Sulfaméthoxazol+ Triméthoprime (SXT), Ciprofloxacine (CIPRO), Chloramphénicol (C), colistine (COL).

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? Les entérocoques : Pénicillines P, Céfazoline (CZ), Ampicilline (AM), Céfotaxime (CTX), Fosfomycine(FOT), Erythromycine (ERY), Lincomycine (L), Spiramycine (SP), Pristinamycine (PR) , Sulfaméthoxazol+ Triméthoprime (SXT), Tétracycline ( TE) , Ciprofloxacine (CIPRO) , Chloramphénicol (C), Vancomycine (VAN) .

.

Tableau III : Les CMI critiques des carbapénèmes.

Antibiotiqu es testés	Charge des disques	Diamètres critiques (mm)				CMI critiques (ug/ml)
	R	I		S	R	I	S	Imipenème
10 ug	=19	20-22		=23	=4	2	=1	Ertapénème
10ug	=18	19-21		=22	=2	1	=0.5

Tableau IV : Les CMI critiques des glycopeptides .

Antibiotiques testés	Charge des disques	Diamètr es critiques				CMI critiques (ug/ml)
	(mm)
	R	I		S	R	I	S	Vancomycine
30 ug	= 14	15-16		=17	= 32	8-16	=4	Teicoplanine
30 ug	=10	11-13		=14	=32	16	=8

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? détermination des CMI par bandelette E-test :

C'est une technique de détermination de la CMI, validée pour les bactéries non exigeantes et pour un certain nombre de bactéries exigeantes.

· Milieu :

Il doit couler en boite de pétrie sur une épaisseur de 4 mm. La gélose doit être séché avant l'emploie

· Préparation de l'inoculum :

A partie d'une culture pure de 18 à 24 heures sur milieu d'isolement approprié, raclé à l'aide d'une anse de platine quelque colonies bien isolées et parfaitement identiques. Bien décharger l'anse et l'écouvillon dans 5 à 10 ml d'eau physiologique stérile à 0.9 %.

Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0.5 MF ou à une DO de 0.08 à 0.10 lue à 625 nm. Ajuster le plus précisément possible. L'utilisation d'un densitomètre est fortement situable.

· Ensemencement :

-Tromper un écouvillon stérile dans l'inoculum.

- l'essorer en le pressant fermement (en le tournant) contre la paroi interne du tube afin de décharger au maximum.

- frotter l'écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, séchée, de haut en bas, en strie serrés.

- répéter l'opération deux fois en tournant la boite de 60 O à chaque fois sans oublier de faire pivoter l'écouvillon sur lui-même. Finir l'ensemencement en passant l'écouvillon sur la périphérie de la gélose.

Dans le cas où l'on ensemence plusieurs boite de pétrie il faut recharger l'écouvillon à chaque fois.

- Ensemencer dans les mêmes conditions la ou les souches de références.

· Dépôt de la bandelette E-test :

- Prélever la bandelette à l'aide d'une pince microbiologique préalablement flambé à bec bunsen.

- Déposer la bandelette délicatement sur la surface gélosée, en commençant par l'extrémité correspondant aux concentrations les plus faibles de l'antibiotique testé puis en progressant jusqu'aux concentrations les plus élevées. Eviter la formation

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des bulles d'air entre la gélose et la bandelette, une fois appliquée la bandelette ne peut être déplacé.

- A noter que l'on ne peut déposer qu'une ou deux bandelettes E-test au maximum par boite de 90 mm (risque de chevauchement des ellipses avec plus d'une bandelette).

- Laisser la boite couvercle en haut pendant 15 min au plus.

- Incuber la boite dans les conditions requises selon la bactérie testée.

· Lecture et interprétation :

- La CMI de l'antibiotique est lue à l' oeil nu, boite ouverte est bien éclairer.

- Elle correspond à la graduation, située à la jonction entre l'éclipse (dessiné par

l'inhibition de la culture bactérienne) et la bandelette E-test .

- Contrôler la qualité du test par la CMI de souche de référence. Se référer au

tableau de lecture fourni au niveau du prospectus E-test.

- Lire ensuite la CMI de la souche bactérienne testée.

- Se référer recommandation du fournisseur pour l'interprétation de cas ambigus

(double zone).

- Comparer les résultats obtenus, aux valeurs critiques figurant dans les tables de

lecture correspondantes.

- Classer la bactérie dans l'une des catégories S, R ou I.

Les bandelettes E-test utilisées dans notre étude : imipénème pour les entérobactéries, vancomycine pour les entérocoques.

Mesure des CMI par automate Walkaway : qui nous permet de faire l'identification et l'antibiogramme tout en mesurant les CMI.

? Test de Hodge modifié (test complémentaire pour la recherche de carbapénèmases) :

La production de carbapénèmases doit être suspectée devant un diamètre d'inhibition autour de l'Ertapénème < 28mm ou une CMI> 0.5mg/l. En cas de suspicion, la production de carbapénèmases doit être confirmée par des méthodes phénotypiques (Test de Hodge) et/ou génotypiques [119].Ce test consiste à ensemencer en culture confluente (à l'aide d'un

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écouvillon) une dilution au 1/10ème d'une suspension de Densité Optique (DO) = 0.5 Mc Farland de la souche E. coli ATCC 25922 sur une gélose Muller Hinton.

Ensuite, un disque d'ertapénème chargé à 10 ug est déposé au centre de la boîte et chaque souche testée est ensemencée de manière radiale à partir du disque jusqu'au bord de la boîte de Pétri. [120,121].

La présence d'une distorsion de la zone d'inhibition autour du disque d'ertapénème au contact de la souche testée est interprétée comme un résultat positif après incubation pendant 18 h à 37°C.

Figure 13 : Test de Hodge modifié d'une souche résistante.