2-Discussion
La â-glucosidase du suc digestif de la
larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) a été
purifiée à homogénéité
électrophorétique selon un protocole de purification comprenant
trois étapes chromatographiques. Ce sont la chromatographie
d'échange d'anion, la chromatographie sur gel filtration et la
chromatographie d'interaction hydrophobe. Le facteur de purification obtenu
à la fin de la purification de la â-glucosidase a
été inférieur à ceux obtenus avec les
â-glucosidases de la larve de Tenebrio
molitor (Ferreira et al., 2001), des petites
foreuses de la canne à sucre, Diatraea
saccharalis (Azevedo et al., 2003) et des
ouvriers du termite Macrotermes subhyalinus. Cependant, ce facteur de
purification a été plus élevé que ceux des
â-glucosidases de l'ouvrier du termite Macrotermes
mulleri (Rouland et al., 1992), de la
bactérie anaérobique intestinale humaine Fusobacterium
K-60 (Park et al., 2001) et de la larve de lumen de
Tenebrio molitor (Ferreira et al., 2003).
La similitude de poids moléculaire
déterminés sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et
beta-mercapto-éthanol et sur gel de filtration suggère que la
â-glucosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est monomérique comme
celle du foie humain (Mutoh et al., 1988) et du
microorganisme Thermus spIB-21 (Kang et al.,
2005).
L'enzyme a été inhibée par le DTNB et le
pCMB. Ceci peut s'expliquer par la présence de groupement(s)
sulfhydryle(s) dans le site actif de l'enzyme. Des résultats identiques
ont été rapportés par Ogawa (1990) et
Taniguchi et Takano (2004) respectivement avec les
â-glucosidases d'Actinidia chinensis,
Leuconostoc mesenteroides et de l'intestin de tilapia.
L'étude de l'hydrolyse de différents glycosides
a permis de tester leur capacité à servir comme substrat. Ainsi,
la â-glucosidase du suc digestif de la larve de
charançon Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est
restée inactive sur les polysaccharides tels que le lichenane, le
xylane, la carboxylméthylcellulose, l'inuline, l'amidon,
l'arabino-galactane et la laminarine. Aucune activité glycosidasique
contaminante telles que les activités
âgalactosidasique,
â-fucosidasique,
â-mannosidasique,
â-arabinosidasique et
â-xylosidasique n'a été signalée.
Les seuls substrats qui ont été hydrolysés par l'enzyme
sont le cellobiose, les cellodextrines, le sophorose, le gentiobiose et le
p-nitrophényl-â-D-glucopyranoside. Ces
résultats montrent que la â-glucosidase est une
exoglucosidase avec une spécificité stricte pour la configuration
anomérique â et du résidu glucosyle. Ce
comportement semble refléter ceux des
â-glucosidases des champignons microscopiques
Sclerotium rolfsii (Shewale et
Sadana, 1981) et Aspergillus
niger (Watanabe et al., 1992). Il est
néanmoins différent de ceux trouvés chez la plupart des
â-glucosidases des insectes.
La constante de Michaelis-Menten (KM) pour le cellobiose (un
produit clé d'hydrolyse de la cellulose par l'exo- et
l'endo-â-D-glucanase) est inférieure à
celles rapportées dans la littérature (Sternberg et
al., 1977 ; Workman et Day, 1982 ; Wase et al., 1985).
La faible valeur de KM obtenue, suggère que cette enzyme purifiée
a une grande affinité pour le cellobiose et pourrait être
utilisée dans le processus de saccharification industrielle de la
cellulose. Le rôle physiologique de la
â-glucosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) serait la digestion de di et
d'oligo-saccharides issus de la dégradation de la cellulose ou de
l'hémicellulose.
La capacité de la â-glucosidase
du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)
à catalyser des réactions de transglucosylation a
été testée avec le cellobiose et le
2-phényléthanol comme respectivement donneur et accepteur de
glucosyle. Le 2-phényléthanol a été utilisée
pour étudier les activités de transglycosylation de la
âglucosidase d'Aspergillus oryzae
(Fortun et Colas, 1991), d'Achatina achatina
(Leparoux et al., 1997), de Thermus
thermophilus (Dion et al., 1999) et de
Macrotermes subhyalinus (Kouamé et al., 2001,
2005a, 2005b) en raison de la facile quantification par absorbance
dans l'UV des produits de transglycosylation
(phényléthylglycosides). Les conditions expérimentales ont
été optimisées par rapport aux facteurs capables d'avoir
une influence sur le taux de transglucosylation. La
â-glucosidase a un pH optimum de transglucosylation (pH
6,6) différent de celui de la réaction d'hydrolyse (pH 5,0). Pour
expliquer cette différence, Huber et al.
(1983) ont suggéré qu'il existe un groupement avec une
valeur de pKa élevée au niveau du site actif qui affecterait
l'hydrolyse mais pas la transglycosylation. Une autre hypothèse serait
que le taux d'hydrolyse de la liaison glycosidique décroît avec
une augmentation du pH de manière à induire le changement
observé (Huber et al., 1983). Dans le cas de
la â-glucosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum (Curculionidae), la variation observée
entre les pH optima d'hydrolyse et la transglycosylation n'a pas
été significative et n'a présenté aucune
opportunité pour favoriser la réaction de synthèse sans
une hydrolyse rapide des produits formés par transglucosylation.
Après 16 h de réaction, les produits formés ont
été hydrolysés par la â-glucosidase
du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
(Curculionidae). L'enzyme ne reconnaissant que le résidu
glucosyle et l'anomérie â, le produit
formé au cours de la réaction de transglucosylation ne peut
être que le phényléthyl-â-glucoside.
Ce résultat suggère que la âglucosidase
hydrolyse le cellobiose à partir de son extrémité
non-réductrice pour libérer le â-
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glucose. Ce mécanisme réactionnel indique que
cette enzyme a opéré par mécanisme de rétention de
configuration anomérique comme c'est le cas des enzymes appartenant aux
familles 1 et 3 des glycosides hydrolases (Henrissat, 1991, 1998 ;
Henrissat et Bairoch, 1993). Le rendement de transglucosylation (20 %)
obtenus avec le 2-phényléthanol et le cellobiose comme
respectivement accepteur et donneur de glucosyle est inférieur à
ceux rapportés par certains auteurs sur d'autres sources de
â-glucosidase (A.oryzae, E. coli).
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