Memoire Online - Caractérisation biochimique et applications potentielles des glucosidases et de la a-galactosidase du suc digestif de la larve de rhynchophorus palmarum (curculionidae)

Selon la représentation de Lineweaver et Burk (1934), la valeur de KM de l'áglucosidase obtenue avec le pNP-á-D-glucopyranoside a été de 0,30 mM tandis que la vitesse maximale _(Vmax) a été de 142,20 UE /mg de protéine. Avec le maltose, le saccharose et le kojibiose, les valeurs de KM ont été respectivement de 1,31 ; 0,42 et 0,57 mM, avec des vitesses maximales respectives de 48,23 ; 77,54 et 62,23 UE/mg de protéine. Les efficacités catalytiques _(Vmax/KM) des substrats naturels tels que le maltose, le kojibiose et le saccharose montrent que l'á-glucosidase a eu un meilleur pouvoir catalytique pour le saccharose (Tableau 12).

1-8-Action des agents chimiques

Les ions métalliques K⁺ et Na⁺ et le triton X-100 n'ont pas exercé d'effet sur l'áglucosidase. Tous les autres agents chimiques testés sont des inhibiteurs. Les ions métalliques Zn²⁺ et Cu²⁺ ont complètement inhibé l'activité de l'á-glucosidase. Le DTNB et l'ion Fe³⁺ ont fortement inhibé cette activité (Tableau 13).

Tableau 12 : Quelques paramètres cinétiques de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Substrat	KM	Vmax	Vmax/ KM
	(mM)	(U/mg)	(U/mM x mg)
p-nitrophényl-á-D-glucopyranoside	0,30	142,20	474,00
Maltose	1,31	48,23	36,81
Saccharose	0,42	77,54	184,61
Kojibiose	0,57	62,23	109,17

Tableau 13 : Effet de quelques agents chimiques sur l'activité de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

	Agents chimiques	Concentration (mM ou %)	Activité relative (%)
	Témoin	1	100
	Ba²⁺	1	56
	Mg²⁺	1	76
	Mn²⁺	1	50
	Sr²⁺	1	81
	Ca²⁺	1	82
Ions	Cu²⁺	1	0
	Zn²⁺	1	0
	Na⁺	1	100
	K+	1	100
	EDTA	1	82
	Fe³⁺	1	7
	Tris	1	10
	â-mercaptoéthanol	0,1	86
Réducteurs	pCMB	0,1	73
	DTNB	0,1	2
	Triton X-100	0,1	100
	Tween 80	0,1	90
Détergents	SDS	0,1	44
	Urée	0,1	88
	Guanidine	0,1	78

1-9-Réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase

Les pH optima de transglucosylation de l'á-glucosidase lorsque le saccharose et le maltose ont été utilisés comme donneurs de glucosyle et le 2-phényléthanol comme accepteur de glucosyle ont été identiques. La valeur a été de 5,0 (Fig. 21).

1-9-2-Influence du temps d'incubation

Les pourcentages maxima de synthèse de phényléthylglucoside ont été obtenus en 12 h de réaction quel que soit le donneur de glucosyle utilisé. Les deux valeurs sont identiques (62 %). Après 12 h de réaction, les pourcentages de transglucosylation ont considérablement diminué (Fig. 22).

1-9-3-Influence de la concentration de l'accepteur sur l'activité de transglucosylation

Les rendements d'activité de transglucosylation ont été meilleurs pour une concentration d'accepteur de 100 mM quel que soit le donneur utilisé. Entre 400 et 600 mM, les pourcentages de transglucosylation ont été très faibles. Il en a été de même pour les concentrations comprises entre 25 et 50 mM (Fig. 23).

L'ensemble des paramètres physico-chimiques des réactions catalysées par l'áglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est repris dans le tableau 14.

1-9-4-Influence de la concentration du donneur sur l'activité de transglucosylation

Le meilleur pourcentage de transglucosylation a été obtenu avec des concentrations de donneur de glucosyle de 400 mM. Au-delà de cette concentration, les pourcentages de transglucosylation ont considérablement diminué (Fig. 24).

Le Tableau 14 récapitule les donnés relatif à la détermination des conditions optimales de transglycosylation

Figure 22 : Influence du pH sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'áglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) Donneur de glucosyle : saccharose ou maltose 400 mM. Accepteur de glucosyle : 2- phényléthanol 100 mM. Tampon acétate 100 mM (pH 3,6-5,4) phosphate 100 mM (pH 5,4-8). Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 12 h.

Figure 23 : Influence du temps d'incubation sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Donneur de glucosyle : saccharose ou maltose 400 mM. Accepteur de glucosyle: 2 phényléthonal 100 mM. Tampon acétate 100 mM pH 5,0. Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 0 à 36 h.

Figure 24 : Influence de la concentration de l'accepteur de glucosyle (2-phényléthanol) sur les réactions de transglucosylation catalysées par l' á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Donneur de glucosyle : saccharose ou maltose 400 mM. Accepteur de glucosyle: 2- phényléthanol (100 à 600 mM). Tampon acétate 100 Mm pH 5,0. Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 12 h.

Figure 25 : Influence de la concentration du donneur de glucosyle sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase de suc digestif de la larve Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Donneur de glucosyle : saccharose ou maltose (0 à 800 mM). Accepteur de glucosyle: 2- phényléthanol (100 à 600 mM). Tampon acétate 100 Mm pH 5,0. Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 12 h.

Tableau 14 : Récapitulatif des conditions optimales des réactions de transglycosylation catalysées par l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) et le meilleur pourcentage de transglucosylation.

Paramètre physicochimique	Valeur
	Saccharose	Maltose
pH optimum de transglucosylation Temps d'obtention du meilleur pourcentage de transglucosylation (h) Concentration du donneur pour l'obtention du meilleur pourcentage de transglucosylation (mM) Concentration de l'accepteur pour l'obtention du meilleur pourcentage de transglucosylation (mM)	5,0 12 400 100	5,0 12 400 100
Meilleur pourcentage de transglucosylation (%)	62	62

La purification à homogénéité électrophorétique de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) du palmier Elaeis guineensis a nécessité l'utilisation de trois étapes chromatographiques à basse pression. Ce sont les chromatographies d'échangeuse d'anion, d'exclusion moléculaire et d'interaction hydrophobe.

La courbe de variation d'activité en fonction de la température de l'enzyme purifiée a donné une température optimale d'hydrolyse de 45 °C indiquant que l'á-glucosidase est un biocatalyseur mésophile. Cette valeur de température optimale est identique à celle de l'áglucosidase du microorganisme Xanthophyllomyces dendrorhous (Marin et al., 2006) et différente de celles des á-glucosidases de la fraction insoluble du cristallin de bovin (50 °C) (Kamei et Fujiyama, 1995) et des microorganismes Candida albicans (37 °C) (TorreBouscoulet et al., 2004) et Thermomonospora curvata (54 °C) (Janda et al., 1997).

Le pH optimum d'hydrolyse de l'á-glucosidase est de 5,6. Il s'agit donc d'une enzyme acide. Lorsque ce pH optimum d'hydrolyse est comparé à ceux des á-glucosidases du muscle de lapin (pH 4,5) (Matsui et al., 1984), du foie du lapin (pH 4,7) (Onodera et al., 1989) et de Pichia pastoris (pH 3,5-4,5), cette enzyme parait moins acide mais elle est plus acide lorsqu'elle est comparée à ceux des á-glucosidases du tube digestif de l'insecte Rhynchosciara americana ( pH 6,0) (Terra et al., 1977), des organes reproducteurs et du plasma du taureau (6,5-7) (Jauhiainen et vanha-Perttula, 1985), des microorganismes Torulaspora pretoriensis YK-1 (pH 6,8) (Oda et al., 1993) et Thermotoga maritima (pH 7,5) (Raasch et al., 2000).

L'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est une protéine monomérique. Cette situation est identique à celles des áglucosidases de l'insecte Drosophila melanogaster (á-glucosidase II and III) (Tanimura et al., 1979), de l'abeille Apis mellifera (Nishimoto et al., 2001 ; Lee et al., 2001) et de l'intestin de rat (Sasajima et al., 1975), mais différente de celles des á-glucosidases du foie de porc (Tashiro et al., 1986), du cortex rénal de lapin (Pereira et sivakami, 1989) et du microorganisme Sulfolobus solfutaricus 98/2 (Suzuki et al., 1987 ; Nakao et al., 1994 ; Rolfsmeier et Blum, 1995) qui sont oligomériques.

L'á-glucosidase est inhibée par le DTNB et le pCMB, ce qui indique la présence de groupement(s) sulfhydryle(s) dans le site actif de l'enzyme. Ce résultat est en accord avec ceux trouvés par Sasajima et al. (1975) et Yoshiki et al. (2005) respectivement sur les á-

glucosidases de la muqueuse de l'intestin de rat et des grains de mil. Il est différent de celui de Prakash et al. (1983) avec l' a-glucosidase de l'intestin de pigeon.

L'a-glucosidase est inactive sur les polymères de poids moléculaires élevés comme le lichenane, le xylane, la carboxyméthylcellulose, l'inuline, l'amidon, l'arabino-galactane. Ce résultat a été déjà observé avec les a-glucosidases de la graine d'épinard Spinacia oleracea (Sugimoto et al., 1995), de Thermomonospora curvata (Janda et al., 1997), des champignons Aspergillus niger et A. oryzae (Kita et al., 1991). Cette enzyme ne possède aucune activité glycosidasique contaminante telles que les activités a-galactosidasique, a-fucosidasique, amanosidasique, a-arabinosidasique a-xylosidasique. Ce comportement cinétique montre que cette enzyme est hautement spécifique du résidu glucosyle. Elle hydrolyse de préférence les liaisons a-(1-2) et a-(1-4). La détermination des paramètres cinétiques a permis d'obtenir une constante de Michaelis-Menten de 0,30 mM lorsque le p-nitrophényl-a-D-glucopyranoside est utilisé comme substrat. Ce résultat est identique à celui rapporté par Kita et al. (1991), dont les travaux ont porté sur l'étude de la spécificité de l'a-glucosidase du champignon Aspergillus niger. Il est différent des études réalisées par Suzuki et al. (1997) sur l'aglucosidase de la bactérie Bacillus Thermoamylotiquefaciens dont la constante déterminée est de 0,56 mM. Les constantes de Michaelis Menten déterminées avec l'a-glucosidase de la larve de Rhynchopholorus palmarum (Curculionidae) utilisant comme substrat le saccharose, le maltose, et le kojibiose sont respectivement de 0,42 ; 1,31 et 0,57 mM. Ces valeurs sont plus faibles que celles des a-glucosidases du foie de rat (Lavrenova et Presnova, 1994), de l'insecte Drosophila melanogaster (Tanimura et al., 1979) et du muscle de lapin (Matsui et al., 1984). Les valeurs des efficacités catalytiques _(Vmax/KM) permettent de dire que l'enzyme purifiée hydrolyse efficacement le saccharose. Cette situation laisse penser que le rôle biologique principal de l'a-glucosidase la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est la dégradation du saccharose contenu dans la sève du palmier. Il s'agit d'une saccharase. En plus de cette action principale, l'a-glucosidase peut assurer efficacement la digestion du maltose et des maltodextrines (sauf l'isomaltose) qui sont des produits d'hydrolyse de l'amidon.

La capacité de l'a-glucosidase de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) à catalyser des réactions de transglucosylation a été testée. Le saccharose et le maltose ont été utilisés comme donneurs de glucosyle et le 2-phényléthanol comme accepteur de glucosyle.

L'intérêt du choix de ces substrats comme donneurs de glucosyle est dû à leur capacité à être
facilement hydrolysés par l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus

palmarum (Curculionidae). Quant à l'accepteur de glucosyle, il présente également des avantages. En effet, le phényléthanol est un composé insoluble dans l'eau. Cette propriété est caractéristique de la plupart des macromolécules naturelles. Les produits (phényléthylglucoside) des réactions de transglucosylation sont facilement quantifiables par absorbance UV. Pour cette facilité de détection, le phényléthanol a été déjà utilisé pour étudier les activités de transglycosylation de glycosidases du champignon Aspergillus oryzae (Fortun et Colas, 1991), de l'escargot géant Achatina achatina (Leparoux et al., 1997), de la bactérie Thermus thermophilus (Dion et al., 1999) et de Macrotermes subhyalinus (Kouamé et al., 2001, 2005a). Les conditions expérimentales de transglucosylation ont été optimisées au niveau de certains facteurs capables d'influencer le taux de transglucosylation. Le pH optimum de transglucosylation de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est de 5,0. Cette valeur est différente du pH optimum d'hydrolyse (5,6). Pour expliquer cette différence de pH, Huber et al. (1983) ont suggéré l'existence d'un groupement ionique avec une grande valeur de pKa au niveau du site actif, ce qui affecterait l'hydrolyse mais pas la transglycosylation. Aussi, cette différence pourrait-elle s'expliquer par le taux d'hydrolyse de la liaison glycosidique qui décroît avec une augmentation du pH de manière à induire le changement observé (Huber et al., 1983). Dans le cas de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae), la différence de pH optimum des réactions d'hydrolyse et de transglucosylation n'est pas significative, ce qui ne permet pas de conduire à des réactions de synthèse à cause de l'hydrolyse rapide des produits de transglucosylation formés. Ainsi, le taux de transglucosylation est plus important que celui de l'hydrolyse du produit formé. Le temps de réaction apparaît comme un paramètre important car certains produits formés durant les réactions de transglucosylation peuvent être utilisés comme substrats et être hydrolysés. Pour l'a-glucosidase étudiée, un taux maximum de transglucosylation a été obtenu dans un temps relativement court (environ 12 h) sans qu'il n'y ait eu hydrolyse des produits formés au cours de la transglucosylation. Apres 12 h de réaction, le pourcentage de transglucosylation a diminué. Le produit formé au cours de la réaction de transglucosylation pourrait être le phényléthyl-a-D-glucoside. Ce résultat suggère que l'a-glucosidase hydrolyse le produit formé par son extrémité non réducteur en libérant l'a-glucose. Ce comportement montre que l'a-glucosidase purifiée a opéré par rétention de configuration anomérique. Le taux de transglucosylation obtenu avec le 2-phényléthanol (62 %) est plus élevé que ceux rapportés dans la littérature avec les sources conventionnelles de glycosidases (E.coli, A. oryza).

Caractérisation biochimique et applications potentielles des glucosidases et de la a-galactosidase du suc digestif de la larve de rhynchophorus palmarum (curculionidae)

1-7-Paramètres cinétiques

1-8-Action des agents chimiques

1-9-Réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase

1-9-2-Influence du temps d'incubation