2.2 Techniques et dosages
2.2.1 Dissociation du muscle squelettique et
cytométrie en flux
Après la dissection du TLA, celui-ci est nettoyé
dans du Phostphate Buffer Saline (PBS) puis mis dans un tube contenant 3mg de
collagénase de type A et 1.5 ml de DMEM 10% de sérum foetal de
veau (SVF). Le TLA est ensuite dissocié grâce à la
collagénase et aux différents temps d'incubations à
37° (une fois 60 minutes puis 15 minutes). Une fois la dissociation
terminée, les culots sont repris dans 1 ml de DMEM 20% SVF. Les cellules
sont ensuite marquées avec des anticorps spécifiques des
protéines d'intérêt (listés ci-dessous)
couplés à différents fluorochromes. Puis elles sont
passées devant un faisceau laser pour mesurer leur taille, leur
granulosité et la longueur d'onde émise par le fluorochrome
après excitation. Les cellules sont donc reconnues en fonction de la
fluorescence qu'elles émettent. Les cellules reprises dans un volume de
300ul de DPBS 0,5% SVF, passent dans le cytomètre. Après
différents contrôles (morphologie, viabilité, compensation
des fluorochromes), les cellules sont analysées individuellement. Trois
types de cellules sont étudiées : Les lymphocytes T, les
macrophages et les cellules satellites à différents temps post
blessure (J4, J7, J9 et J14).
Tableau 1 : Types cellulaires et anticorps
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Types cellulaires
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Anticorps et fluorochromes
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Cellules satellites
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CD34- FITC/ Iá7-APC
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Macrophages
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F4/80-APC/ CD11b-PEcy7/ CD11c-PE
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Lymphocytes T totaux
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CD3-PE/ CD4-APC/ CD8-PERCP
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2.2.2 Extraction d'ARN, Reverse transcription (RT) et PCR
quantitative (qPCR) Les ARN totaux sont extraits à partir de 1/3
des muscles TLA lysés dans 1mL de trizol auquel est ensuite
ajouté du chloroforme. Ils sont ensuite précipités sur la
nuit avec
11
de l'isopropanol. Après lavage avec de l'éthanol
70%, les ARN sont repris dans de l'eau ne contenant pas de RNase et
dosés avec la technique de spectrophotométrie (Nanodrop).
Ensuite, les ARN sont rétro-transcrits grâce au kit QuantiTech
reverse transcription (Qiagen) afin d'obtenir de l'ADN complémentaire
(ADNc). Après l'élimination de l'ADN génomique par ajout
du gDNA « wipeout » buffer, 1 ug d'ARN est rétro-transcrit
pendant 30 minutes à 42°C avant l'inactivation de l'enzyme par la
chaleur (95°C) pendant 3 min. Enfin, l'ADNc est
récupéré puis dilué au 1/50 en présence de
0.3uM de primer listés ci-dessous, et de SYBRGreen (Takara). Toutes les
réactions de qPCR sont réalisées en triplicats. La
quantité relative des ARNm est calculée selon la méthode
de CT comparatif et le gène 36B4 est utilisé comme gène de
référence.
Tableau 2 : Séquences des primers
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Nom
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Séquence
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PPARâ
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F-AGATGGTGGCAGAGCTATGACC/R-TCCTCCTGTGGCTGTTCC
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PDK4
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F-GGGTCTCAATAGTGTCACC/R-GTGGGCCTGGGCATTTAGCA
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CD34
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F-GGAGTTCTGCTGGCCATCTT/R-TAAGGGTCTTCACCCAGCCTT
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Pax7
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F-CGATTAGCCGAGTGCTCAGA/R-GGAGGTCGGGTTCTGATTCC
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MyoD
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F-AGCACRACAGTGGCGACTCA/R-GCTCCACTATGCTGGACAGG
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Myf5
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F-TGAGGGAACAGGTGGAGAAC/R-AGCTGGACACGGAGCTTTT
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MRF4
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F-AGAGGGCTCTCCTTTGTATCC/R-CTGCTTTCCGACGATCTGTGG
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Myogénine
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F-AACTACCTTCCTGTCCACCTTCA/R-GTCCCCAGTCCCTTTTCTTCCA
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Myostatine
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F-CAGCCATGGTAGTAGACCGC/R-TACAGCCTGTGGTGCTTGAA
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36B4
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F-TCCAGGCTTTGGGCATCA/R-CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA
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