2.1.1 Animaux
48 souris mâles sauvages de type C57Bl/6J,
âgées de 10 semaines à J0 (Charles Rivers, France) sont
hébergées à l'animalerie dans des cages de 2 ou 4 souris,
à une température ambiante (20°). La moitié des
souris (n=24) est traitée avec du GW0742 par voie orale (dans
l'alimentation). L'autre moitié des souris est
supplémentée avec le véhicule (DMSO). Les animaux sont
blessés au TLA 15 jours après le début du traitement, sont
sacrifiés à différents temps par dislocation cervicale et
les muscles TLA sont récupérés immédiatement
après le sacrifice.
2.1.2 Traitement au GW0742 par l'alimentation
La moitié des souris reçoit de la nourriture
standard (AO4) supplémentée en GW0742 (3 mg/kg/jour). Pour cela,
2g de bicarbonate est dissout dans 1L d'eau miliQ, puis 28mg de GW0742 sont
rajoutés ou non suivant la nourriture produite. Ensuite, 1kg de
croquettes est mélangée dans la solution. L'autre moitié
des souris, qui sont les souris
9
« contrôle » ne reçoivent que de la
nourriture supplémentée en DMSO (véhicule). Tous les 3 ou
4 jours, la nourriture restante et les souris sont pesées, puis la
nourriture est renouvelée.
2.1.3 Blessure musculaire
Après 15 jours de traitement, les souris sont
blessées, sous anesthésie gazeuse (Vetflurane) à la patte
gauche avec une injection de 50 ul de cardiotoxine (0,03 mg/ml, purifiée
à partir du venin de serpent Naja pallida) et reçoivent une
injection de 50ìl de sérum physiologique à la patte droite
(patte contrôle). Pour des raisons éthiques, un anti-douleur
(Buprenorphine) est administré en sous-cutané (Buprecare :
30ìg/ml) 20 minutes avant l'anesthésie.
2.1.4 Evaluation des capacités
fonctionnelles
Une partie des souris (celles sacrifiées aux jours 7 et
14 post-blessure), est évaluée physiquement la veille de
l'injection de cardiotoxine et la veille du sacrifice. Les souris sont
habituées à faire les tests une semaine avant l'évaluation
des tests physiques.
- Grip test :
Le grip test permet d'évaluer la force maximale des
membres supérieurs des souris. Les souris sont tenues pas la queue,
s'agrippent à l'appareil et l'opérateur essaie d'éloigner
la souris de la barre. Le test est répété plusieurs fois
(au minimum deux fois) et la meilleure valeur est retenue. La force maximale
est mesurée en Newton par gramme (N/g).
- Tapis roulant :
L'exercice consiste à courir en un temps limite sur un
tapis roulant incliné à 5° (1 heure maximum) au moins
à 30 cm/s (35cm/s les 15 dernières minutes) après une
augmentation progressive de l'intensité de l'effort (30 secondes
à 15 cm/s, 30 secondes à 20 cm/s, 30 s à 25 cm/s). Les
souris reçoivent des stimulations électriques (0,2 mA a une
fréquence de 0,25 Hz) pour stimuler la course (maximum 50 stimulations).
L'exercice est arrêté lorsque les souris ont reçu plus de
50 stimulations.
2.1.5 Sacrifice et prélèvement des
tissus
6 souris traitées au GW0742 et 6 souris traitées
au DMSO sont sacrifiées aux différents temps par dislocation
cervicale. Elles sont ensuite pesées puis les TLA gauches
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et droits sont récupérés et pesés.
Sur 4 souris traitées au GW0742 et 4 souris traitées au DMSO, les
2/3 de chaque TLA sont récupérés pour la technique de
dissociation des cellules musculaires et de cytométrie en flux et le
tiers restant (haut du TLA) est mis à congeler à -80° pour
la technique de RT qPCR. Sur les 4 autres souris, chaque TLA est
prélevé et mis dans un tube avec de l'Optimal Cutting Temperature
compound (OCT) puis congelé à -80° pour la technique
d'histologie et d'immunohistochimie.
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