3.2.2 Effet du traitement GW0742 sur la réponse
immunitaire
(macrophages et lymphocytes T) induite par la blessure
dans le muscle TLA.
Au jour 4 post-blessure, les macrophages totaux, de type M1 et
de type M2 sont en nombres plus élevés dans les pattes
blessées GW0742 comparées aux pattes blessées DMSO (Figure
6-A). Il n'y a pas de différence significative de quantité d'ARNm
de CD68 (Figure 6-B) au jour 4 post-blessure. Au regard du nombre de
lymphocytes T totaux (CD3), une tendance (p=0,08) à une
sur-représentation de cette population est observée au jour 4 et
7 chez les souris GW0742 comparativement au souris DMSO, dans les pattes
contrôles, sans différence significative au jour 14 post-blessure
(Figure 7). L'ensemble de ces effets apparait montrer une réponse
immunitaire globale plus marquée en réponse au traitement par le
GW0742.
4. Discussion
Dans ce mémoire, nous nous sommes demandé si une
activation pharmacologique de la voie PPARâ peut conduire à une
accélération du processus de régénération
impliquant des effets sur les phases inflammatoires et de réparation.
L'activité de la voie PPARâ peut être augmentée de
deux façons : par une augmentation de l'expression de la protéine
PPARâ et/ou par une augmentation de son activation en augmentant la
quantité de ligand (Neels et Grimaldi., 2014). Dans notre étude,
nous avons traité des souris avec du GW0742, un agoniste puissant et
spécifique de PPARâ, dans l'objectif d'augmenter l'activation de
PPARâ dans le TLA. L'augmentation observée, dans le TLA, de
l'expression de PDK4, un gène-cible de PPARâ, après 15
jours de traitement au GW0742 administré dans l'alimentation des souris,
témoigne que le l'agoniste a bien induit l'activation de PPARâ.
Cet effet est d'une amplitude comparable à celui induit en
réponse à 48h de traitement GW0742 administré par voie
sous-cutanée (Giordano et al., 2008).
Nous montrons que les effets du GW0742 observés dans
les TLA des souris non blessées, ne sont pas totalement similaires
à ceux observés dans les TLA non blessés des souris qui
ont subi une blessure sur l'autre patte. En effet, la blessure dans le TLA a
conduit à une diminution de l'expression de PPARâ lui-même,
significative au jour 4 post-blessure et davantage marquée chez les
souris traitées avec du GW0742. L'augmentation de l'activité de
la voie JNK (voie du stress impliquée dans la réponse
inflammatoire) en réponse à la blessure (Alter et al., 2008)
pourrait expliquer cet effet.
21
En effet, cette voie apparait jouer un rôle dans la
régulation du niveau d'expression de PPARâ (Rousseau et al.,
2016). PPARâ est par ailleurs connu, dans d'autres modèles
cellulaires, pour être impliqué dans la régulation de
l'inflammation par son interaction physique avec la sous-unité p65 de
NF-êB, inhibant par ce biais son activité transcriptionnelle
(Neels et Grimaldi., 2014). Cet effet pourrait-être dépendant du
niveau d'expression protéique de PPARâ (Neels et Grimaldi., 2014).
Il est donc possible que la baisse de l'expression de PPARâ en
réponse à la blessure, soit une réponse adaptative pour
permettre une moindre interaction inhibitrice de PPARâ sur la voie
NF-êB et ainsi permettre l'activité transcriptionnelle de ce
dernier. NF-êB est en effet un facteur de transcription impliqué
dans l'expression de plusieurs cytokines pro-inflammatoires dont le
TNF-á qui est connu comme nécessaire au bon déroulement du
processus de régénération (Chen et al., 2005). Nous avons
également montré une plus forte augmentation du nombre de
macrophages et de lymphocytes T CD3 infiltrés au jour 4 post-blessure
chez les souris traitées au GW0742, dans les pattes contrôles et
dans les pattes blessées. L'ensemble de ces effets nous laisse penser
que le traitement au GW0742 augmente le stress inflammatoire induit par la
blessure. En parallèle, la quantité de myostatine est plus faible
chez les souris traitées au GW0742 par rapport aux souris DMSO au jour
4. Il a été montré qu'une inhibition de l'expression de la
myostatine favorise l'infiltration des macrophages durant les premiers jours de
la régénération musculaire (McCroskery et al., 2005) et
favorise l'activation et la prolifération des cellules satellites. Le
mécanisme est encore peu étudié mais l'infiltration des
macrophages serait due à une augmentation de la quantité de
chémoattractants dans l'environnement de la blessure (Siriettet al.,
2006). Nous pouvons donc suggérer que l'augmentation du nombre de
macrophages observable au jour 4 post-blessure plus marquée en
réponse au traitement GW0742 est, au moins en partie, la
conséquence de la baisse de l'expression de la myostatine et donc
possiblement de son activité. Toutefois, il est connu que l'activation
de PPARâ favorise l'angiogenèse (Gaudel et al., 2008 ; Wagner et
al., 2009). L'augmentation de la capillarisation du muscle, induite par le
traitement, pourrait également expliquer un nombre de cellules
immunitaires (macrophages et lymphocytes) infiltrées, également
observable dans les pattes contrôles, plus élevé dans le
TLA des souris traitées.
22
Pour rappel, les macrophages jouent un rôle crucial lors
de la phase de régénération du muscle. Il a
été montré qu'en l'absence de macrophages, le délai
de prolifération et de différenciation des cellules satellites
est augmenté (Segawa et al., 2008). En effet, les macrophages
pro-inflammatoires (de type M1) vont permettre aux cellules satellites
d'entamer leur prolifération (Chazaud B et al., 2009) et sont
prédominants dans le muscle après la blessure avant que
n'augmente le nombre de macrophages anti-inflammatoires (de type M2) qui eux
vont permettre aux myoblastes de se différencier et de fusionner
(Chazaud B et al., 2009). Dans notre étude, les macrophages sont en
nombre plus élevé dans le muscle jusqu'au septième jour
puis leur nombre diminue, ce qui est en accord avec d'autres études sur
la régénération musculaire (Novak et al., 2014 ; Wang et
al., 2014). De plus, le traitement au GW0742 conduit à la fois à
un nombre de macrophages de type M1 mais aussi de type M2 plus
élevé dans le muscle, observable 4 jours post-blessure, que le
traitement avec du DMSO, sans différence au jour 7. Le rôle des
macrophages dans le processus de régénération est
dépendant non seulement de leur nombre et de leur profil mais aussi de
la chronicité de leur présence (Mann et al., 2011), ce qui laisse
penser que leur présence en plus grand nombre chez les souris
traitées avec du GW0742 puisse être favorable à une
réponse adaptative plus marquée à la blessure. En effet,
nous observons sur plusieurs marqueurs de la régénération
un retour plus rapide (7 jours versus 14 jours) vers des valeurs de base, chez
les souris traitées avec du GW0742 comparativement aux souris
contrôles. De manière intéressante, et même si nous
ne l'avons pas quantifié dans le cadre de ce travail, l'augmentation du
nombre de macrophages devrait s'accompagner d'une modification des
sécrétions de cytokines. Sachant que les cytokines telles que le
TNF-á, l'IL-1â et l'IL-6 sont sécrétées par
les macrophages pro-inflammatoires et favorisent la prolifération des
cellules satellites (Strle et al., 2006; Otis et al., 2014; Cantini et al.,
1995), et que l'IL-10, et l'IL-4 sont sécrétées par les
macrophages anti-inflammatoires et favorisent la différenciation des
myoblastes (Villalta et al., 2011; Horsley et al., 2003), nous pensons qu'une
augmentation aigue des macrophages à la fois de type M1 et de type M2
dans les premiers jours suivant la blessure peut favoriser la
prolifération et la différenciation des cellules satellites et
donc être "bénéfique" au processus de
régénération. Toutefois, nous n'avons pas montré de
différence significative, liée au traitement, sur la
quantité de Myf5, de MyoD et de Myogénine (marqueurs de
prolifération et de différenciation des cellules satellites)
au
23
jour 4 post-blessure. En accord avec l'étude de Lee et
al (2013) les gènes Myf5, MyoD, myogénine et myostatine varient
de la même façon, dans notre étude, en réponse
à une blessure musculaire induite. En revanche, au regard des effets du
traitement GW0742, nos résultats diffèrent de ceux de Gaudel et
al (2008) qui, chez la souris qui n'était pas sujette à une
blessure musculaire et dont le traitement était administré par
voie sous-cutanée pendant une durée de 96h maximum, montraient
une augmentation de l'expression de Myf5 et de MyoD. De manière
intéressante, les effets montrés étaient rapides et
transitoires. En effet, l'expression de Myf5 est élevée
dès 2h post-injection puis diminue significativement après 48h de
traitement. De même, l'expression de MyoD est élevée
dès 5h de traitement, reste élevée jusqu'à 48h de
traitement, mais retourne à des valeurs de base après 96h (Gaudel
et al., 2008). Une autre étude (Lee et al., 2016) a montré qu'en
traitant des C12 en culture avec du GW0742 pendant 2 jours, la quantité
d'ARNm de MyoD et de Myogénine était significativement
augmentée. Ces études diffèrent méthodologiquement
de la notre au regard du modèle utilisé (C12, TLA de souris non
blessées) et du traitement (durée, mode d'administration). Dans
notre étude, au jour 7 post-blessure, le traitement au GW0742 semble
avoir l'effet inverse des effets du GW0742 préalablement montrés
sur les gènes de Myf5 et de Myogénine (Gaudel et al., 2008 ; Lee
et al., 2016). En effet, la quantité d'ARNm de Myf5 et de
Myogénine revient à un niveau basal dès le
7ème jour de blessure, chez les souris traitées au
GW0742 comparées aux souris DMSO pour qui les quantités d'ARNm
reviennent à leur niveau de base au jour 14 post-blessure. Il est tout
à fait possible de penser que le retour à des valeurs basales
d'expression soit plus rapide mais nous pouvons également penser que la
cinétique d'expression de ces marqueurs entre le jour de la blessure et
le jour 4 soit décalée vers une réponse plus
précoce chez les souris traitées au GW0742. Dans ce dernier cas,
cette réponse pourrait-être déjà terminée 48h
après la blessure. Il serait donc intéressant, dans une prochaine
étude, de regarder ces marqueurs dans les heures qui suivent la
blessure. En parallèle aux effets observés sur les marqueurs de
prolifération et de différenciation et probablement en
cohérence avec ces effets, l'expression du facteur MRF4, un marqueur de
fusion des myocytes et présent dans les fibres matures (Chargé et
al., 2004), est plus basse au jour 4 post-blessure chez les souris
traitées au GW0742 comparée aux souris DMSO. Cet effet laisse
suggérer que sa moindre expression favorise la prolifération et
la différenciation des cellules satellites.
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Enfin, il est observable dans notre étude que la
Myostatine reste exprimée de manière plus faible dans les pattes
blessées comparées aux pattes contrôles jusqu'au jour 14
post-blessure quel que soit le traitement administré. Il est connu que
la diminution de l'expression de la Myostatine favorise l'activité de la
voie Akt/mTOR (voie de synthèse protéique) impliquée dans
la différenciation et la fusion des myocytes ainsi que dans la
maturation des fibres musculaires (Park et al., 2005 ; Amirouche et al., 2009 ;
Miyabara et al., 2010). Il est donc possible que l'expression de la Myostatine
ne soit pas revenue à un niveau de base car la voie Akt/ mTOR doit
être active pour terminer le processus de maturation des fibres. De plus,
les capacités physiques d'endurance des souris, ne sont pas revenues au
niveau de leur performance initiale, malgré le fait que la masse
musculaire de la patte blessée ne soit pas différente de la patte
contrôle au jour 14 post-blessure, et que les souris ne présentent
pas de problème biomécanique, visible, lors de la marche et de la
course. L'absence de retour à un niveau d'expression de base de la
myostatine ou identique au niveau d'expression dans le TLA de la patte non
blessée au jour 14 post-blessure, suggère que la patte
blessée n'a pas complétement régénéré
au jour 14 quel que soit le traitement administré.
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