àƒ??°valuation du diagnostic par PCR directe et PCR-élisa sur les ITS des trypanosomes pathogàƒÂ¨nes du bétail

Introduction

La trypanosomose animale africaine (TAA) est une maladie parasitaire responsable d'une morbidité élevée et souvent d'une mortalité non moins importante chez le bétail. Cette maladie est à l'origine de pertes économiques considérables, elle entraîne notamment une forte chute de production de lait et de viande. De par ses conséquences néfastes, cette pathologie aggrave la pauvreté et l'insécurité alimentaire dans les pays où elle sévit de façon endémique. Particulièrement dans les zones subhumides d'Afrique au sud du Sahara, la trypanosomose animale transmise par les glossines est un des obstacles majeurs au développement de l'élevage^1(*). L'enjeu de la lutte contre la TAA est de ce fait de taille, mais il existe un préalable : le diagnostic.

L'absence de signes pathognomoniques confère au diagnostic clinique, un caractère de simple suspicion. Le diagnostic de certitude de la trypanosomose requiert forcement des techniques de laboratoire. De nos jours, le diagnostic de laboratoire de la TAA repose sur trois ensembles de techniques : parasitologiques, séro-immunologiques et moléculaires. Les techniques parasitologiques, qui en révélant le parasite dans les liquides biologiques de l'hôte sont des diagnostics de certitude, mais se heurtent à une insuffisance de sensibilité et de spécificité. Les méthodes sérologiques, qui en mettant en évidence le plus souvent des anticorps sont plutôt des diagnostics de présomption, car ces tests ne différencient pas les infections passées et guéries et les infections présentes.

Dans ce contexte, les outils de la biologie moléculaire ont apporté une révolution notoire dans les tests d'identification précise des trypanosomes. Il s'agit des sondes nucléiques et de l'amplification en chaîne par polymérase (ACP = PCR en anglais). La technique d'hybridation moléculaire par les sondes nucléiques a été appliquée chez les glossines (Gibson et al., 1988 ; Masiga D. K. et al., 1996 ) et les bovins (Nyeko et al., 1990). Elle tend à être remplacée par la technique de PCR.

Depuis les travaux précurseurs de Mooser et al. (1989), la PCR est de plus en plus utilisée pour le diagnostic des TAA. Comparativement aux méthodes parasitologiques et séro-immunologiques, cette technique bénéficie d'un gain substantiel en spécificité, sensibilité et rapidité (Solano et al., 1997 ; Desquesnes et Davilà, 2002). Dans cette technique, plusieurs régions de l'ADN ont servi de marqueurs moléculaires dont entre autre les séquences de l'ADN satellite (Moser et al., 1989 ; Masiga et al., 1992 ; Lefrançois et al., 1999), les mini exons de l'ADN nucléaire (Desquesnes et Davilà, 2002), la petite sous unité de l'ADNr (SSU-rDNA) (Geysen et al., 2002) et les espaceurs internes transcrits de l'ADNr (ITS) (Mc Laughlin et al., 1996 ; Desquesnes et al., 2001 ; Desquesnes et al., 2002 ; Guèye, 2003).

Excepté les séquences de l'ADN ribosomal, les autres marqueurs moléculaires ont permis le développement d'une PCR basée sur l'utilisation de couple d'amorces spécifiques d'espèces. Avec ces dernières, la PCR demeure encore délicate à être utilisée comme outil de diagnostic de routine. Le coût de la PCR est en effet élevé (1$ US par réaction) et la diversité des espèces pathogènes peut conduire chez les bovins par exemple à la réalisation de cinq réactions différentes pour un même échantillon. Pour lever cette contrainte économique de la PCR, l'utilisation des amorces polyspécifiques amplifiant l'ITS1 est actuellement l'une des options les plus explorées. Ainsi, à l'aide d'un couple unique d'amorces, la PCR permet l'identification et la distinction de toutes les espèces pathogènes de trypanosomes du bétail^1(*).

Au CIRDES, des amorces (Tryp 4R et Tryp 4S) pour la PCR directe sur les ITS de l'ADNr des trypanosomes, ont été mises au point et nécessitent d'être évaluées et validées. D'autre part pour la PCR-ELISA, des sondes d'ADN spécifiques aux ITS des principales espèces pathogènes ont été dessinées. Il conviendra d'adapter la technique de PCR sur les ITS à la PCR-ELISA, puis de l'évaluer et éventuellement de la valider pour le diagnostic.

Il résulte donc de nos travaux, l'évaluation de deux nouvelles techniques de diagnostic, à savoir la PCR directe et la PCR-ELISA sur les ITS des trypanosomes. Nous avons présenté dans une première partie, une revue bibliographique portant sur les généralités des trypanosomoses animales. Dans cette partie, nous avons évoqué dans un premier chapitre les caractères généraux des trypanosomes du bétail en Afrique. Le second chapitre de la synthèse bibliographique traite de la trypanosomose des animaux domestiques, particulièrement en Afrique. Nous avons d'une part abordé dans ce chapitre l'importance de la maladie et son étude épidémio-clinique, d'autre part nous avons décrit les méthodes de diagnostic de la trypanosomose animale, avant de présenter les différentes composantes des moyens de lutte contre cette maladie. La deuxième partie intitulée «  étude expérimentale » est consacrée à la présentation des protocoles de travail utilisés. Les résultats qui en découlent seront discutés afin d'aboutir à des recommandations pour l'amélioration et l'utilisation optimale de ces nouvelles techniques de diagnostic.

* ¹ On estime que cette maladie menace plus de 48 millions de bovins dans les pays infestés par les glossines, le petit nombre de zones exemptes de glossines est surpeuplé par plus de 170 millions de bovins (FAO, 2002)

* ¹ Sans toutefois pouvoir distinguer les espèces à l'intérieur du sous genre Trypanozoon (Desquesnes et al., 2001).