LISTE DES TABLEAUX
Pages
Tableau I : Programme
d'amplification de la PCR monospécifique 67
Tableau II : Températures
d'hybridation des sondes utilisées pour la
PCR-ELISA 76
Tableau III : Résultas
positifs obtenus avec les organes de mouche en
PCR classique 79
Tableau IV :
Prélèvements sanguins de bovins positifs aux tests de
diagnostic 82
Tableau V : Résultas positifs
obtenus avec les organes de mouche en
PCR-ITS 83
Tableau VI : Organes de
mouches positifs en PCR classique et
PCR-ITS 83
Tableau VII :
Récapitulatif des résultats obtenus en PCR classique
PCR-ITS 84
Tableau VIII : Estimation du
coût de l'analyse en PCR-ELISA pour une
plaque 99
Tableau IX : Estimation du
coût de l'analyse d'un échantillon en PCR-ITS 100
Table des matières
Pages
Introduction 1
Première partie : Etude bibliographique
4
Chapitre 1 :Caractères
généraux des trypanosomes du bétail en Afrique.........
5
1.
Trypanosomatidae.............................................................................
5
1-1.
Morphologie..............................................................................5
1-2. Structure et
physiologie.................................................................7
1-3.
Classification............................................................................
8
2. Principaux trypanosomes pathogènes du
bétail en Afrique........................10
2-1. Sous genre
Nannomonas.....................................................................10
2-1-1. Trypanosoma (Nannomonas)
congolense........................................10
2-1-2. Trypanosoma (Nannomonas)
simiae..............................................11
2-2. Sous genre Duttonella : Trypanosoma
vivax............................................11
2-3. Sous genre
Trypanozoon.....................................................................12
2-3-1. Trypanosoma (Trypanozoon)
brucei..............................................12
2-3-2. Trypanosoma (Trypanozoon)
evansi..............................................13
2-3-3. Trypanosoma (Trypanozoon)
equiperdum.......................................14
2-4. Sous genre Pycnomonas : Trypanosoma
suis..........................................14
3. Cycle évolutif
................................................................................14
3-1. Chez la
glossine........................................................................14
3-2. Chez l'hôte
mammifère...............................................................15
4. Vecteurs et modes de
transmission......................................................17
4-1. Vecteurs à transmission
mécanique.................................................17
4-1-1.
Tabanidés........................................................................17
4-1-2.
Stomoxyinés.....................................................................18
4-1-3.
Hippoboscidés...................................................................18
4-2. Vecteurs à transmission cyclique : Les
glossines....................................18
5.
Pathogénie....................................................................................21
6. Génome des
trypanosomes................................................................22
6-1. ADN
nucléaire.........................................................................22
6-2. ADN kinétoplastique
(ADNk).......................................................23
7. Propriétés
antigéniques.....................................................................23
7-1. Antigènes
invariants.....................................................................24
7-2. Antigènes variables de
surface........................................................24
7-3. Variation
antigénique..................................................................24
Chapitre 2 : Trypanosomose des animaux
domestiques....................................26
1.
Importance....................................................................................26
2. Etude
clinique.................................................................................27
2-1.
Symptômes..............................................................................27
2-2.
Lésions...................................................................................29
3.
Epidémiologie.................................................................................30
4.
Diagnostic.....................................................................................32
4-1. Diagnostic sur le
terrain...............................................................32
4-1-1. Diagnostic
épidémiologique...................................................32
4-1-2. Diagnostic clinique et diagnostic
différentiel................................33
4-2. Diagnostic au
laboratoire..............................................................33
4-2-1. Diagnostic chez l'hôte
mammifère............................................34
4-2-1-1. Méthodes
directes.........................................................34
4-2-1-1-1. Méthodes
parasitologiques.......................................34
4-2-1-1-1-1. Examens microscopiques
directs..........................34
4-2-1-1-1-2. Examens microscopiques après
concentration..........35
4-2-1-1-1-3. Inoculation à des animaux de
laboratoire................36
4-2-1-1-2. Méthodes
moléculaires............................................37
4-2-1-1-2-1. Rappel sur la structure de
l'ADN.........................37
4-2-1-1-2-2. Technique d'hybridation
moléculaire....................38
4-2-1-1-2-3. Amplification en chaîne par polymérase
ou PCR......39
4-2-1-1-2-3-1. Définition, principe et
réalisation..................39
4-2-1-1-2-3-2. Autres techniques de
PCR...........................41
4-2-1-1-2-3-3. Sensibilité et spécificité
.............................42
4-2-1-1-2-3-4. Avantages et champs
d'application................42
4-2-1-1-2-3-5.
Limites.................................................43
4-2-1-2. Méthodes indirectes ou
séro-immunologiques........................43
4-2-1-2-1. Test
d'agglutination................................................44
4-2-1-2-2. Réaction de fixation du
complément............................44
4-2-1-2-3. Test d'Immunofluorescence indirecte
(IFI).....................45
4-2-1-2-4. Test
ELISA.........................................................45
4-2-2. Diagnostic chez le
vecteur......................................................46
4-2-2-1. Chez les insectes hématophages vecteurs
mécaniques...............46
4-2-2-2. Chez les
glossines.........................................................46
5. Moyens de
lutte..............................................................................47
5-1. Chimiothérapie et
chimioprophylaxie...............................................48
5-1-1.
Chimiothérapie..................................................................48
5-1-2.
Chimioprophyalxie.............................................................48
5-2. Lutte
antivectorielle....................................................................49
5-3. Lutte génétique par gestion des
troupeaux..........................................50
Deuxième partie : Etude
expérimentale........................................................52
Chapitre 1 : Présentation du cadre
d'étude...................................................53
Chapitre 2 : Matériel et
méthodes................................................
..............55
1.
Matériel........................................................................................55
1-1. Matériel de
laboratoire...............................................................55
1-2. Matériel
biologique...................................................
...............56
1-2-1. Souches de trypanosomes témoins (ADN
purifiés)......... ...........56
1-2-2. Echantillons de
terrain.......................................... ...........56
1-2-2-1. Couches de globules blancs du sang des bovins (buffy
coats) 56
1-2-2-2. Organes de mouches..............................
..................56
1-2-2-3. Fragment cible : les ITS des trypanosomes.........
..............57
1-3. Réactifs et solutions de
travail.....................................................59
1-3-1. Pour la PCR
directe...........................................................59
1-3-1-1. Nucléotides
(dNTP).......................................... ........59
1-3-1-2. Oligonucléotides
(amorces).................................... .....59
1-3-1-3. Tampon de la
PCR........................................................60
1-3-1-4. Taq
polymérase............................................................60
1-3-1-5. Diméthylsulfoxyde
(DMSO)............................................61
1-3-2. Pour la révélation par
ELISA...............................................61
1-3-2-1. dNTP et
Digoxigénine....................................................61
1-3-2-2. Anticorps anti-digoxigénine conjugués
à la peroxydase.............61
1-3-2-3. Sondes marquées à la biotine et solution
d'hybridation..............62
1-3-2-4.
Streptavidine...............................................................64
1-3-2-5. Solution de lavage et tampon de
blocage..............................64
2.
Méthodes......................................................................................64
2-1. Préparation des
échantillons.......................................................64
2-1-1. Echantillons d'ADN
purifiés..................................................64
2-1-2. Traitement au chelex® des échantillons de
terrain.........................65
2-2. Principe de la
PCR...................................................................65
2-3. Protocole de PCR
classique........................................................66
2-3-1. Réalisation du mélange
réactionnel...........................................66
2-3-2. Programme
d'amplification....................................................67
2-3-3. Electrophorèse et visualisation des produits
PCR...........................68
2-4. Protocole de PCR-ITS avec les amorces Tryp 4R et
Tryp 4S...............68
2-4-1. Réalisation du mélange
réactionnel...........................................68
2-4-2. Programme
d'amplification....................................................69
2-4-3. Electrophorèse, visualisation et
interprétation des produits PCR.........70
2-5.
PCR-ELISA...........................................................................70
2-5-1. Principe et
méthodes..........................................................70
2-5-2. Protocole de
PCR-ELISA....................................................73
2-5-2-1. Réalisation du mélange
réactionnel....................................73
2-5-2-2. Programme
d'amplification.............................................74
2-5-2-3. Détection des produits PCR sur gel
d'agarose........................74
2-5-2-4. Révélation des produits d'amplification
par ELISA.................74
2-5-3. Choix des
sondes...............................................................74
2-5-4. Evaluation des
sondes.........................................................74
2-5-5. Optimisation de la
technique................................................75
Chapitre 3 : Résultats et
discussion........................................................77
1.
Résultas........................................................................................77
1-1. Méthodes
parasitologiques..........................................................77
1-2. PCR
classique..........................................................................77
1-2-1. Echantillons sanguins de
bovins...............................................78
1-2-2. Organes de mouches...........................
................................79
1-3.
PCR-ITS................................................................................80
1-3-1. Echantillons sanguins de
bovins...............................................80
1-3-2. Organes de mouches.................................
..........................82
1-4. Analyse comparative des résultats PCR
classique / PCR-ITS...............84
1-4-1. Cas d'infections à Trypanosoma
vivax......................................84
1-4-1-1. Buffy coats de bovins.................................
..................84
1-4-1-2. Organes de mouches....................................
..............85
1-4-2. Cas d'infections au genre Nannomonas
(Trypanosoma congolense)86
1-4-2-1. Buffy coat de
bovins......................................................86
1-4-2-2. Organes de
mouche.......................................................86
1-4-3. Cas d'infections au genre Trypanozoon
(T. brucei)......................87
1-5. PCR
ELISA............................................................................88
1-5-1. Résultats de l'évaluation des
sondes....................................... 88
1-5-1-1. Sur des ADN
purifiés.................................................... 88
1-5-1-2. Sur des échantillons de terrain
..........................................90
2.
Discussion.....................................................................................91
2-1. Evaluation comparative PCR-ITS / PCR
classique...........................91
2-1-1.
Sensibilité........................................................................91
2-1-2.
Spécificité........................................................................93
2-2. Spécificité et sensibilité des
sondes nucléiques pour la PCR-ELISA.......95
2-2-1.
Spécificité........................................................................95
2-2-2.
Sensibilité.........................................................................96
2-3. Etude de
coût...........................................................................97
2-4. Avantages de la PCR directe et de la PCR-ELISA sur
les ITS............100
Conclusion et
recommandations...............................................................102
Références bibliographiques
..................................................................105
Annexes
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