àƒ??°valuation du diagnostic par PCR directe et PCR-élisa sur les ITS des trypanosomes pathogàƒÂ¨nes du bétail

4-2-1. Diagnostic chez l'hôte mammifère

4-2-1-1. Méthodes directes

4-2-1-1-1. Méthodes parasitologiques

Le principe général de ces techniques est la mise en évidence des parasites dans un liquide biologique de l'hôte. Le diagnostic peut porter sur un prélèvement de sang, de ganglion lymphatique, de liquide céphalo-rachidien (forme nerveuse de la maladie), de sécrétions génitales, sur un calque d'organe. Les prélèvements sont réalisés selon les cas, à l'état frais ou sur du matériel biologique fixé ou ayant été congelé. La récolte des prélèvements doit être effectuée aussi proprement possible, en évitant au maximum les souillures.

4-2-1-1-1-1. Examens microscopiques directs

Il s'agit de rechercher les parasites à l'état frais ou après fixation, soit directement dans le sang (le plus souvent), soit après enrichissement. L'observation microscopique immédiate d'une goutte de sang est la méthode classique, mais de nos jours elle est peu employée du fait de sa faible sensibilité. L'etalement sanguin fixé au méthanol et coloré au giemsa permet d'identifier sur la base des critères de morphologie et de morphométrie, le sous genre auquel appartiennent les trypanosomes. Selon le contexte épidémiologique en examen de routine, le diagnostic d'espèce peut être déduit. La méthode de coloration la plus usitée est la méthode panoptique qui associe deux colorants: le May-Grünwald et le Giemsa (Itard, 2000). L'etalement sanguin peut être également coloré au Giemsa dilué après fixation au méthanol. Cette technique permet des études morphologiques détaillées et l'identification des différentes espèces de trypanosomes (OIE, 2000).

4-2-1-1-1-2. Examens microscopiques après concentration

Ces examens regroupent un ensemble de méthodes plus sensibles que l'observation directe des parasites et repose sur le principe de la concentration des parasites avant l'examen microscopique. En effet, la concentration des trypanosomes facilite grandement leur recherche, surtout lorsque la parasitémie est faible. Elle est obtenue soit par centrifugation d'un volume donné de sang total, soit après filtration des trypanosomes, soit après la lyse des hématies.

? La technique qui donne pour une application pratique sur le terrain les meilleurs résultats est la centrifugation différentielle en micro tubes à hématocrite de l'interface globules / plasma : il s'agit de la technique de centrifugation hématocrite (HCT ou test de WOO) (Woo, 1970). Elle est rapide et économique, de plus elle fournit une évaluation de l'état d'anémie de l'animal. La sensibilité est variable selon l'espèce, par exemple pour T. vivax on a jusqu'à 1250 trypanosomes / ml de sang (Desquesnes et Tresse, 1996). Par ailleurs, une double micro centrifugation améliore considérablement la sensibilité de cette méthode en permettant de déceler des infections très légères (CIRDES, 2001).

La méthode de MURRAY (BCM= Buffy Coat Method) est aussi une variante de la technique de centrifugation hématocrite, on coupe le tube capillaire par une pointe diamant ½ mm au-dessous de la couche leucocytaire appelée buffy coat où se concentrent les trypanosomes constituant l'interface entre le plasma au-dessus et les hématies en dessous. Un examen exhaustif de ce matériel est réalisé à l'état frais (ou après fixation et coloration) entre lame et lamelle au microscope à fond noir (Murray et al., 1977) ou à contraste de phase. A partir des critères de morphologie et de morphométrie, on arrive toujours à identifier le sous genre auquel appartient le parasite.

Toutefois, la sensibilité relative des méthodes de Woo et de Murray est assez controversée selon les auteurs et les espèces parasitaires, elles sont généralement voisines et sont de l'ordre de 100 à 1000 parasites / ml de sang (Desquesnes, 2003).

? La lyse des globules rouges par un détergent (Dodécyl Sulfate de Sodium) nécessite des manipulations nombreuses et des temps d'incubation et de centrifugation relativement longs, pour un faible gain de sensibilité. Elle est aussi difficilement réalisable sur le terrain. Elle n'est donc pas couramment utilisée.

? La séparation des trypanosomes par filtration du sang sur colonne de DEAE (Diethyl amino-ethyl)-Cellulose repose sur les propriétés électrostatiques de la DEAE cellulose à un pH choisi de fixer les cellules sanguines et non les trypanosomes (Lanhan et Godfrey, 1970). C'est une technique très sensible, très utile au laboratoire pour préparer de grandes quantités de trypanosomes. Mais elle est difficilement applicable au diagnostic sur le terrain (Itard, 2000). En revanche, la technique dite « miniature anion exchange centrifugation technique » (mAECT) permet de réaliser des diagnostics avec une sensibilité plus élevée que celle de l'HCT, mais elle est plus longue que cette dernière.

4-2-1-1-1-3. Inoculation à des animaux de laboratoire 

Pour la culture in vivo, la technique la plus couramment utilisée est l'inoculation intra péritonéale ou en sous cutané de matériel biologique infecté à des animaux sensibles. L'animal de choix est la souris sûrement indemne d'infection. L'inoculation par voie scrotale chez le lapin permet de faire le diagnostic de la dourine. La culture in vivo est une méthode très sensible, surtout pour le sous genre Trypanozoon, elle est par contre inopérante avec T. vivax qui n'infecte pas les rongeurs. La culture du parasite in vivo ne peut être pratiquée de façon courante sur le terrain, en raison du nombre d'animaux et du matériel nécessaires à sa mise en application.

La culture in vitro n'a pas d'application pratique pour le diagnostic des trypanosomes animaux, sauf pour la mise en évidence de T. theileri. Le diagnostic est rarement effectué car le parasite est peu pathogène.

4-2-1-1-2. Méthodes moléculaires

Le diagnostic des trypanosomes auparavant basé sur différentes observations microscopiques et sérologiques chez l'hôte mammifère ou chez le vecteur, a été depuis les années 1980 amélioré avec les outils de la biologie moléculaire basés sur la détection de l'ADN (Desquesnes et Davilà, 2002). Ces nouvelles techniques de détection et d'identification offrent en effet, une sensibilité et une spécificité jusqu'à présent inégalables. Des sondes d'ADN spécifiques d'espèces de trypanosomes ont été élaborées et utilisées dans les tests de diagnostic de la trypanosomose (Kukla B. A et al., 1987 ; Dickin S. K et al., 1989). De nos jours, la technique d'hybridation moléculaire par les sondes nucléiques tend à être supplantée par la technique de PCR. Cette dernière considérée comme la plus sensible et la plus spécifique, fut mise en place au CIRDES en 1993 afin de pouvoir diagnostiquer de manière fiable les trypanosomes pathogènes du bétail, aussi bien chez l'hôte mammifère que chez les glossines vectrices (Duvallet et al., 1994 ; Desquesnes et Tresse, 1996).

4-2-1-1-2-1. Rappel sur la structure de l'ADN

L'ADN, acronyme d'acide désoxyribonucléique, est une longue molécule que l'on retrouve chez tous les organismes. Cette molécule est formée de deux chaînes parallèles de nucléotides enroulées en hélice et reliées par leurs bases azotées. Chaque nucléotide renferme un groupement phosphoré, un sucre (désoxyribose) et une base azotée. Quatre bases ont été identifiées : l'Adénine (A) et la Guanine (G) appartiennent à la famille des Purines; la Thymine (T) et la Cytosine (C) sont de la famille des Pyrimidines. Un brin d'ADN est formé de la répétition ordonnée de ces quatre bases. Deux brins anti- parallèle d'ADN sont dits complémentaires car toujours étroitement reliés entre eux par des liaisons faibles (de type hydrogène) formées entre les bases complémentaires. Il y a deux liaisons entre A et T et trois liaisons entre G et C. Ainsi, une molécule double brin composée uniquement (ou en majorité) de G-C nécessitera plus d'énergie pour être ouverte, qu'un ADN de même taille composé de A-T. Ceci explique pourquoi la température de fusion (Tm) de l'ADN varie en fonction de sa taille (exprimée en nombre de bases, généralement en Kilobase Kb ou en Mégabase Mb) et de son rapport (A+T) / (C+G).

Figure 9 : structure de l'ADN

4-2-1-1-2-2. Technique d'hybridation moléculaire 

Deux chaînes monocaténaires d'acides nucléiques peuvent former un duplex, grâce à l'établissement de liaisons hydrogène entre des paires de bases purines -pyrimidines (A-T ou A-U ; C-G). Cette association surtout quand elle s'opère in vitro est dite hybridation et n'est possible que si les séquences des 2 chaînes sont complémentaires. Tel est le principe de la technique du diagnostic par les sondes nucléiques.

Une sonde nucléique est un fragment d'acides nucléiques (ADN ou ARN) capable de reconnaître dans une préparation, une séquence nucléotidique spécifique complémentaire à la sienne et de former avec celle ci une molécule double brin ou duplex stable au cours d'une réaction dite d'hybridation. La spécificité de la réaction d'hybridation est fonction de la séquence nucléotidique choisie comme sonde (Kodjo et al., 1993). On distingue, d'une part les sondes radioactives ou sondes chaudes qui sont des acides nucléiques marqués avec des isotopes radioactifs (P^² et H). D'autre part, on a les sondes dites froides car ne comportant aucun élément radioactif. Le système de détection est alors basé sur une enzyme qui s'est révélée par sa capacité à transformer un substrat (incolore en général) en un produit facilement détectable (le plus souvent coloré). La phosphatase alcaline est l'enzyme la plus utilisée. De nos jours, on emploie de plus en plus les oligonucléotides comme sondes. Ce sont de simples brins d'acides nucléiques d'une longueur de 15 à 35 nucléotides synthétisés par des machines suivant la séquence du gène à chercher. Ils sont marqués soit à l'une des extrémités avec un nucléotide modifié, soit directement avec l'enzyme servant à la détection.

L'hybridation moléculaire est utilisée depuis longtemps en recherche fondamentale, afin de déterminer le degré de parenté entre les génomes d'êtres biologiques, isoler des gènes, établir leurs séquences ou analyser leur fonctionnement. Ces outils ont été adaptés pour permettre de faire des distinctions très fines dans les populations de parasites. Pour les trypanosomes, les travaux de l'ILRAD et de l'Université de Bristol, ont principalement permis de développer des sondes reconnaissant les différentes espèces ou sous espèces (Itard, 2000).

4-2-1-1-2-3. Amplification en chaîne par polymérase ou PCR

4-2-1-1-2-3-1. Définition, principe et réalisation

La PCR est une technique permettant l'amplification sélective in vitro des séquences d'ADN. Elle fut découverte en avril 1983 par Kary Mullis et développée par Henri A. Herlich et ses collaborateurs de la compagnie CETUS (Californie, USA) en décembre 1985 (Larzul, 1993). Cette nouvelle technique de diagnostic permet d'amplifier en quelques temps (quelques heures) un fragment connu d'ADN : le recopier en plusieurs millions d'exemplaires. La PCR rend ainsi possible la détection d'une molécule d'ADN aussi petite que 100 paires de nucléotides présente à un seul exemplaire dans un prélèvement biologique même en quantité infime.

Le principe de la PCR se fonde sur l'utilisation de manière répétitive de la propriété des ADN polymérase de pouvoir synthétiser un brin d'acide nucléique complémentaire qu'à partir d'un couple d'amorces (Etienne, 1996). La PCR est en effet dérivée de la technique dite « d'extension des amorces », au cours de laquelle des courtes séquences d'ADN (oligonucléotides) sont utilisées comme des amorces par l'enzyme de réplication. Cette enzyme permet de repérer le fragment d'ADN ou de gène précis, puis de le multiplier rapidement (Higuchi, 1989).

Cette polymérisation est artificiellement obtenue en imposant des cycles thermiques à un mélange constitué de l'ADN matriciel (issu de l'échantillon à tester), des dNTP (désoxynucléotides triphosphate, c'est à dire les dATP, dCTP, dGTP et dTTP), d'un tampon adéquat, d'un couple d'amorces et de la Taq polymérase^1(*). La PCR est en fait, la répétition de 3 étapes thermiques réalisées successivement dans un même tube. Les étapes d'un cycle thermique sont :

Ø une étape de dénaturation des acides nucléiques, au cours de laquelle on a la séparation des deux simples brins de l'ADN;

Ø une étape d'hybridation, pendant laquelle les amorces oligonucléotidiques viennent s'hybrider sur leur séquences complémentaires;

Ø enfin, une étape d'élongation durant laquelle, il y a extension des amorces (dans le sens 5'?3') par l'ADN polymérase en enfilant les dNTP pour constituer le brin complémentaire.

A la fin du premier cycle d'amplification, le nombre de brins d'ADN a doublé, à partir de 2 brins d'ADN initiaux on obtient 4 séquences après un cycle, 8 après 2 cycles, 2ⁿ après n cycles. Après 20 cycles une seule séquence cible d'ADN est amplifiée plus d'un million de fois. Cette valeur est purement théorique et correspond à un rendement idéal de 100 % pour chaque réaction. Le rendement initialement décrit pour les réactions d'élongation était de l'ordre de 50 à 60 % (Saiki et al., 1985).

4-2-1-1-2-3-2. Autres techniques de PCR

Pour le diagnostic de la trypanosomose animale, la PCR utilisant les amorces spécifiques d'espèces décrites par Masiga et al. (1992) constitue la technique de PCR classique encore appelée PCR monospécifique. Dans cette dernière, ce sont les ADN satellites qui sont les séquences cibles à amplifier. Par contre, la PCR utilisant des couples d'amorces polyspécifiques amplifiant les espaceurs internes transcrits (ITS) de l'ADNr est appelée PCR multispécifique ou PCR plurispécifique ou encore PCR-ITS.

De nos jours la PCR a considérablement évolué et de nouveaux types de PCR ont été mis au point pour améliorer la sensibilité et la spécificité de cette nouvelle technique, il s'agit entre autre de :

la PCR dite « Nested PCR », elle fait intervenir une seconde PCR réalisée en utilisant des nouvelles amorces situées à l'intérieur du fragment nucléotidique obtenu avec le premier couple d'amorces. Le fragment à amplifier lors de la seconde PCR est plus court, ce qui réduit par conséquent les hybridations non spécifiques (Guèye, 2003) (fig. 10);

Figure 10 : Schéma de l'amplification par PCR nested de l'ITS 1 de l'ADN

Ribosomal

la PCR ELISA est une technique dont les produits d'amplification sont révélés par un test ELISA à la place d'une électrophorèse sur gel d'agarose. Cette méthode a été mise au point pour identifier les trypanosomes à la suite d'une amplification des ADN satellites (Kosum et al.; 2002 ; Masaké et al., 2002; Sow, 2004).

4-2-1-1-2-3-3. Sensibilité et spécificité de la PCR

La PCR offre une extrême sensibilité permettant de détecter une molécule d'ADN aussi petite que 100 paires de nucléotides présente à un seul exemplaire dans un prélèvement biologique. Cette sensibilité dépend de plusieurs paramètres, dont la répétitivité de la séquence amplifiée et les techniques de préparation des échantillons. Cependant, la sensibilité de la PCR reste limitée, voire insuffisante par essence, lorsque les agents infectieux ne circulent pas ou circulent à des taux unitaires inférieures au volume de l'échantillon traité. Le cas est fréquent pour les trypanosomes pour lesquels les périodes aparasitémiques constituent une limite biologique à l'application de la PCR sur le sang frais ou ses dérivés.

En dehors de sa sensibilité, la PCR se distingue des autres techniques de diagnostic par sa grande spécificité d'espèce. Cette dernière dépend de la stabilité du complexe d'hybridation entre l'amorce et l'ADN cible. Différents facteurs s'associent pour former cette stabilité, parmi lesquels on la taille des amorces, la température de fusion et d'hybridation des amorces, la durée de l'étape d'hybridation et la concentration des réactifs. Au cours de la PCR, la synthèse des produits spécifiques entre en compétition avec la synthèse des produits non spécifiques. Ces produits parasites générés au cours d'étapes d'hybridation / extension à basse température sont nuisibles à l'amplification des séquences spécifiques (Saiki, 1989).

4-2-1-1-2-3-4. Avantages et champs d'application

La PCR est une technique qui possède de nombreux atouts. Tout d'abord une quantité très faible de matériel initial est nécessaire pour sa réalisation. La purification des séquences nucléiques n'est pas nécessaire, la PCR pouvant être effectuée sur un lysat cellulaire. (Larzul, 1993). L'amplification s'effectuant sur des courtes régions d'ADN, cette technique peut s'appliquer à l'ADN partiellement dégradé. Il faut en plus noter la simplicité et la rapidité de la technique.

Décrite dans la publication initiale pour le diagnostic d'une anomalie génétique (Saiki et al., 1985), la PCR a vu son champ d'application s'étendre de manière considérable tant pour le diagnostic qu'en recherche fondamentale. Comme le matériel de départ peut être pratiquement amplifié à l'infini, toutes les méthodes d'analyse de l'ADN peuvent être envisagées. Il peut s'agir de séquençage après clonage des produits amplifiés (Saiki et al., 1985); de séquençage direct des produits PCR. L'utilisation d'amorces appropriées (qui sont physiquement incorporées dans la séquence cible) permet d'effectuer des substitutions de nucléotides, des insertions, des délétions sur le produit d'amplification, facilitant ainsi les études de mutagenèse. Par conséquent, de par sa capacité à amplifier et à modifier une séquence d'ADN, la PCR est devenue l'outil de base des laboratoires de génétique moléculaire.

4-2-1-1-2-3-5. Limites de la PCR

Paradoxalement les limites de la PCR sont dues à son extrême sensibilité. Par ses qualités exceptionnelles, la PCR pose des problèmes méthodologiques importants. La réaction produit donc de manière exponentielle des produits d'amplification qui sont autant de contaminants potentiels. Seule l'observation de conditions de travail extrêmement rigoureuses décrites par Kwok et Higuchi permettent de minimiser les risques de faux positifs (Higuchi., 1989). Par ailleurs, des problèmes de reproductibilité pour un même échantillon d'une PCR à l'autre ont été rapportés, surtout lorsqu'il s'agit d'une séquence rare. Une PCR dite « anémique » a aussi été évoquée (Mullis et al., 1986). Il s'agit d'une PCR au cours de laquelle la synthèse des séquences spécifiques entre en compétition avec celle des produits non spécifiques.

* ¹ La découverte d'une eubactérie thermophile vivant dans les sources chaudes (70-75°C) du Yellowstone National Park, Thermus aquaticus et l'utilisation par la suite de sa polymérase : la Taq polymérase, stable jusqu'à des températures proches de 100°C, sont à l'origine du développement de cette technique (Tagu, 1999).