Memoire Online - à‰tude comparative d'un Test de Diagnostic Rapide du paludisme (TDR) avec la Goutte Epaisse (GE) a l'hôpital régional de Bafoussam au Cameroun

Notre étude a été menée à Bafoussam, chef-lieu de la région de l'Ouest ; plus exactement dans l'unité de laboratoire de l'Hôpital Régional (HRB).

Située en plein centre de la région, la ville de Bafoussam comprend 03 communes ou arrondissements à savoir : Bafoussam I ; Bafoussam II et Bafoussam III. Sa population constituée essentiellement de l'ethnie Bamiléké est estimée en 2008 à environs 347 000 habitants avec une densité de 128,5Hbts/km² (BUCREP, 2010). Cette population est majoritaires constituée de personnes exerçant les activités agro-pastorales et le petit commerce ( http://www.bafoussam.fr/bafoussam_geographie.htm).

De par son faciès épidémiologique dit d'altitude et des hauts plateaux, la transmission du paludisme ici est permanente tout au long de l'année avec cependant des variations saisonnières (www. Impact-malaria.com)

Au niveau de la pyramide sanitaire du pays, l'HRB se situe au niveau intermédiaire. Il est la structure de référence pour toutes les autres formations sanitaires de la Région de l'Ouest; notamment tous les hôpitaux de District et les CMA y compris les formations sanitaires privées. Il est dirigé par un Directeur assisté d'un Conseiller médical. Cette structure d'après les sources de la Direction emploie à ce jour (Novembre 2010) plus de 300 personnels dont 10 médecins spécialistes, 01 pharmacien et une quinzaine de médecins généralistes, répartis dans les différents services administratifs et techniques. Comme services techniques on a les services de Médecine A, B et C, de Chirurgie A et B, de Gynécologie, de maternité, de Pédiatrie, de néonatologie, d'Ophtalmologie, d'Oto-rhino-laryngologie (ORL), de Stomatologie de la morgue et l'unité de Laboratoire.

L'unité de laboratoire de l'HRB avec un plateau technique unique en son genre à l'Ouest emploie à temps plein plus de 25 professionnels de laboratoire. Elle a à sa tête un Médecin-Biologiste (Chef d'unité), assisté d'un Ingénieur des Techniques Médico-Sanitaires (Bactériologiste, chef de service).

Le nombre moyen de patients reçu par jour dans cette unité est de 60, avec une moyenne par patients de 4 examens, pour environs 240 examens par jour. Le poste de Parasitologie exécute en moyenne de 10 recherches d'Hémoparasites (Gouttes épaisses) par jour (moyenne calculée à partir des chiffres de l'année 2010)

· Avoir été reçu en consultation à l'HRB par un médecin ou un infirmier et envoyé au laboratoire pour confirmation du paludisme (Goute épaisse) durant la période allant du 14 juillet au 13 Septembre 2011.

· Avoir accepté de participer à l'étude (pour les enfants, l'accord des parents ou accompagnateur majeur sera nécessaire).

Ø Critères de non inclusion : N'ont pas été inclus dans la présente partie de cette étude :

- les patients venus au laboratoire pour contrôle post traitement de paludisme ;

- les patients dont l'état général est très altéré et les patients se sachant atteints d'une affection chronique (TB, Diabète, etc...) ;

- les malades ayant commencé un traitement antipaludéen y compris la une cycline (Antibiotique) au plus 24 heures avant la consultation.

Nous avons procédé à un échantillonnage par convenance. En effet, nous avons systématiquement recruté, tous les patients qui remplissaient les critères d'inclusion pendant la durée de collecte. Soit au total 336 personnes des deux sexes âgées d'au moins un an.

Les patients en consultation externe ont été reçus au service de prélèvement du Laboratoire tandis que ceux hospitalisés ont été reçus par les infirmières de service concernés.

Après avoir pris connaissance de la demande d'examen formulée par un consultant de l'Hôpital Régional (carnet de consultation ou bulletin d'examen), le technicien-préleveur ou l'infirmière de service s'est chargé d'expliquer à chaque patient (ou accompagnateur) les buts et objectifs de l'étude, il lui a été ensuite remis un formulaire de consentement éclairé (Pour les mineurs, leur ayant droit était sollicité). Après accord de celui-ci manifesté par la signature du formulaire de consentement, Si le patient remplissait alors les conditions requises, un numéro d'identification lui était alors attribué et le cas échéant et la fiche de collecte était remplie suivi du recueil au niveau du pli du coude de 2,5 ml de sang sous tubes EDTA (anticoagulant) comme d'ailleurs c'est le cas en routine dans ce laboratoire. Le respect strict des règles de bonnes pratiques des prélèvements sanguins (OMS, 1994) était de rigueur.

Les données sociodémographiques et cliniques recueillis ont été acheminées en même temps que les échantillons collectés au Laboratoire de l'Hôpital Régional (Poste de parasitologie) dans les 10 minutes suivant la collecte. Les échantillons de sang ont aussitôt été analysés simultanément mais en aveugle par 2 techniciens différents. La Goutte épaisse (GE) sera considérée comme « gold standard ». Les performances du Diaspot®-Malaria-Pf seront alors évaluées par rapport à elle.

Pour réaliser la présente étude, nous avons au préalable sollicité et obtenu auprès de Madame la Directrice de l'HRB (Annexe 1), l'autorisation de réaliser nos travaux de recherche au laboratoire de l'Hôpital Régional, notamment le recrutement des patients et la réalisation des différentes analyses. Par la suite nous avons sollicité et obtenu la clairance éthique (Annexe 2) auprès du comité national d'éthique (CNE). Nous avons aussi sollicité et obtenu par signature, le consentement éclairé de Chaque participant ou mandataire qui, par ailleurs était libre de participer à l'étude. Le questionnaire auquel chacun était soumis était anonyme et les examens ont été exécutés selon les règles de bonnes pratiques de laboratoire (OMS, 1994). Les positifs confirmés ont tous été pris en charge conformément à la procédure en vigueur à l'HRB.

8.2. Variables cliniques (5) : Céphalées, courbatures, frissons, fatigue généralisée et fièvre (T° axillaire > 37,5° ou > 37° pour la T° rectale) ont été recueillies par questionnaire soit par interrogatoire, soit à partir du carnet de consultation. Il s'est agi des signes/symptômes présentes au moment du prélèvement ou dans la semaine précédent la consultation.

La lame porte objet était étiquetée du numéro patient ; identique à celui inscrit à la fois sur le tube de sang et dans les fiches questionnaires. Une goutte de sang était déposée au centre. A l'aide d'une seconde lame, on procède à la défibrination mécanique par des mouvements circulaires de sorte à avoir un diamètre d'environ 1 cm.(Figure 4). Les lames étaient ensuite séchées à l'abri des poussières et des mouches.

Dans une éprouvette en plastique de 100 ml: ajouter 5 ml de Giemsa-Rapide pour 45 ml d'eau distillée tamponnée (quantité suffisante pour 25 lames). Agiter le mélange très doucement. Cette quantité de 50 ml permet de colorer un nombre important de lames.

Recouvrir chaque lame sèche de Giemsa fraichement préparé et laisser agir 30 minutes

Rincer délicatement à l'eau du robinet puis sécher à l'abri des poussières. Dans les pays anglosaxons, le Giemsa est souvent remplacée par le Colorant de Wright (Annexe 6)

La lecture des gouttes a été effectuées au poste de parasitologie du laboratoire de l'HRB à l'aide d'un microscope optique (Nikon Eclipse E400, Japon ; Olympus Optical co, Japon) à l'objectif 100 (à immersion) et selon les procédures recommandées (OMS, 1994) par le responsable du poste, un technicien expérimenté avec 17 ans d'expériences (Figure 10)

La parasitémie a été quantifiée selon la formule suivante (Moody, 2002 ; WHO, 2005 ; Payne, 1988): P = (X / Y) 8000 parasites par mm3 de sang où X est le nombre de parasites comptés au microscope, Y le nombre de leucocytes comptés en même temps (200 leucocytes) et 8000, le chiffre consensuel du nombre de GB/mm3 chez l'Homme . La lecture de 200 champs microscopiques était nécessaire pour rendre une rendre un résultat négatif.

Les résultats des GE ont notés en même temps dans le cahier de paillasse et dans la fiche des résultats. Les densités parasitaires étaient groupées en 3 classes : < 500/ul (faiblement positif) ; 501 - 5 000/ul (positif) ; > 5000/ul (Fortement positif (Figure 11)).

NB. : La réalisation d'un frottis n'a été nécessaire qu'en cas de difficulté réelle à confirmer un diagnostic d'espèce sur GE. Leur réalisation (confection frottis, coloration et lecture) a été faite comme indiquée au paragraphe 6.1.)

En fin de journée, le Médecin-Biologiste Chef de laboratoire choisissait au hasard 02 lames positives (éventuellement) et 02 lames négatives pour valider les résultats de la microscopie

Figure 10 : Microscopiste faisant la

lecture d'une GE.

Figure 11 : Vue microscopique d'une GE colorée au Giemsa (x 100). (On y observe 7 GB et des trophozoïtes de P. falciparum)

Source : (Laboratoire HRB, 2011)

Sans consulter les registres de paillasse, l'investigateur a réalisé sur les mêmes échantillons de chaque journée un TDR (Diaspot®-Malaria-Pf), dans le respect strict des procédures dictées dans la notice contenue dans le coffret (Annexe 7).

Le Diaspot®-Malaria-Pf se présente sous forme d'un coffret blanc contenant 40 tests unitaires en forme de savonnettes emballées individuellement avec un dessicant ; 2 flacons d'1 ml chacun de tampons (buffer) ; 40 pipettes compte-gouttes et une notice du test. Tant que l'emballage individuel n'est pas altéré, il peut être conservé entre 8 et 30° et donc à température ambiante, jusqu'à la date d'expiration indiquée sur le coffret et sur chaque emballage de même que le numéro de lot. Pour la présente étude, nous avons eu besoin de 9 coffrets de de Diaspot®-Malaria-Pf, soit 360 tests unitaires.

C'est un test immunochromatographique qui permet de détecter la HRP2 de P. falciparum dans le sang total d'un patient à l'aide d' anticorps monoclonaux spécifique fixés sur une membrane en plastique.

Outre le sang prélevé sous EDTA, Nous avons eu besoin des cassettes de Diaspot®-Malaria-Pf, la solution tampon (buffer), des pipettes compte-goutte (10 uL), tous fournis par le fabricant.

Figure 12 : Echantillons sanguins prélevés sur EDTA, prêts à être analysés avec Diaspot®-Malaria-Pf (laboratoire HRB, 2011)

· Respecter les précautions universelles en matière de manipulation des produits biologiques (port des gants, blouses...) (OMS, 1994)

· Mélanger le sang par retournement du tube et, à l'aide de la pipette compte-goutte ou d'une micropipette, prélever environ, 10ul de sang total puis verser dans le puis (S).

· Ajouter aussitôt 3 gouttes (environs 120 ul) de tampon en maintenant le tube verticalement. (éviter la formation des bulles d'air)

· Attendre au plus 15 minutes la migration du mélange le long de la membrane du test, puis lire la réaction et interpréter le résultat.

- Test Positif (+): En plus du trait (C) apparition d'un trait intensité (faible à fort) dans la zone (T) ; soit 2 traits (Figure 13 : 264/24 et 263/11)

- Test Négatif (-): seulement le trait (C) apparait (Figure 13 : 279/28 et 279/21)

- Résultats invalides : Pas de trait rouge à la zone contrôle (C) quel que soit ce qui se passe dans la zone (T) : Refaire le test en utilisant une autre cassette.

· N'est pas conseillé pour les régions où il existe de fortes proportions de cas de paludismes à P. non falciparum.

· Peut ; même si c'est rare, être faussement positif (facteurs rhumatoïdes, post traitement)

· Peut-être faussement négatif (délétion possible de HRP2 chez certaines souches de P. falciparum, Ig anti-HRP2 chez le patient, [HRP2] < seuil du test)

Les résultats des Diaspot®-Malaria-Pf ont été consignés quotidiennement sur la fiche de collecte et dans un registre particulier.

- les données cliniques (Fièvre, courbatures, céphalées, frissons et fatigue)

- les données biologiques (résultats de TDR et GE) ont été enregistrées quotidiennement dans un ordinateur jusqu'à la fin de la période de collecte.

Les données biologiques (résultats de GE et des Diaspot®-Malaria-Pf), nous ont permis d'obtenir des variables tels que les Vrais Positifs (VP)= Positifs en GE et au Diaspot® -Malaria-Pf ; les Faux Positifs (FP)= Positifs uniquement au Diaspot®-Malaria-Pf ; les Vrais Négatifs (VN)= Négatifs au Diaspot®-Malaria-Pf et à la GE ; et les Faux Négatifs (FN)= négatifs uniquement Diaspot®-Malaria-Pf. Ces variables mises dans un tableau 2x2 nous ont permis de calculer les caractéristiques du Diaspot®-Malaria-Pf tels que la sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives (positives et négatives).

Les analyses ont été réalisées avec les logiciels Epi-Info version 6.04 (Centers for Disease Control and Prévention, Atlanta, USA) et Excel 2010. Le seuil de significativité pour comparer deux proportions a été fixé à une valeur P <0,05.

· Prévalence (P) : Proportion des malades(M) dans une population (N) à un moment donné.

Avec M= Total des cas confirmés positifs et N= Total des cas testés (population d'étude)

· Sensibilité (Se) : Capacité du Diaspot®-Malaria-Pf à pouvoir détecter les sujets atteints de paludisme (Sujets GE+) dans notre population d'étude. Elle mesure ainsi l'aptitude du test à éliminer les faux négatifs (FN).

· Spécificité (Sp): Capacité Diaspot®-Malaria-Pf à détecter des sujets indemnes de Paludisme (GE-) dans notre population d'étude. Elle mesure ainsi l'aptitude du test à éliminer les faux positifs (FP).

· Valeur Prédictive Positive (VPP) : Probabilité qu'un patient ait réellement le paludisme (GE+) lorsque son test Diaspot®-Malaria-Pf est positif.

· Valeur Prédictive Négative (VPN) : Probabilité pour qu'un patient soit vraiment indemne lorsque son test Diaspot®-Malaria-Pf est négatif.

à‰tude comparative d'un Test de Diagnostic Rapide du paludisme (TDR) avec la Goutte Epaisse (GE) a l'hôpital régional de Bafoussam au Cameroun

III. METHODOLOGIE :